陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)人小梁細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究

1、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)人小梁細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】     目的：觀察脂質(zhì)體是否能介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)移至人小梁細(xì)胞及脂質(zhì)體潛在的毒副作用。方法：通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA 的比例，熒光顯微鏡觀察目的基因的表達(dá)。結(jié)果：小梁細(xì)胞內(nèi)可見脂質(zhì)體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白表達(dá)，高濃度脂質(zhì)體導(dǎo)致細(xì)胞死亡和脫落。結(jié)論：陽離子脂質(zhì)體可有效介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)移至小梁細(xì)胞內(nèi)。但高濃度對(duì)正常的細(xì)胞有一定的毒副作用。     【

2、關(guān)鍵詞】  小梁細(xì)胞 脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染    Liposome mediated gene transfer into human trabecular meshwork cellsXiaoChun Mao, Gang Huang, ShaoWei Zhang, GenGuo WangDepartment of Ophthalmology , Xiangfan Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Xiangfan 441021, Hubei Province,ChinaAbstractAIM:

3、 To evaluate the efficiency of liposome mediated gene transfer to trabecular endothelial cells and cells damage caused by liposome.METHODS: The ratio of cationic liposome to green fluorescein protein (GFP) expression plasmid for high efficacy of transfection was tested in vitro. The GFP expression w

4、as observed by using fluorescence microscopy.RESULTS: The GFP expression in trabecular endothelial cells was observed, However ,high concentration liposome caused the death and falling off of trabecular endothelial cells. CONCLUSION: Liposome seems to be able to deliver genes to trabecular endotheli

5、al cells with efficacy, but high concentration liposome used here is to some extent harmful to corneal endothelial cell.KEYWORDS: trabecular endothelial cells; liposomes; transfection0引言    原發(fā)性開角型青光眼( primary open angle glaucoma, POAG) 是最常見的致盲眼病之一, 其主要的病理變化就是小梁細(xì)胞數(shù)目減少以及細(xì)胞外基質(zhì)增多。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

6、，增加小梁細(xì)胞數(shù)量有望為治療POAG提供一種新的治療手段，但實(shí)現(xiàn)這一愿望需要解決基因轉(zhuǎn)移及基因表達(dá)調(diào)控兩個(gè)關(guān)鍵問題1。我們嘗試?yán)藐栯x子脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA介導(dǎo)報(bào)告基因轉(zhuǎn)移至小梁細(xì)胞, 通過觀察外源基因在小梁細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及脂質(zhì)體對(duì)小梁細(xì)胞的毒性，探索脂質(zhì)體應(yīng)用于小梁細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的安全濃度范圍，從而為陽離子脂質(zhì)體載體應(yīng)用于小梁細(xì)胞的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料 標(biāo)本與試劑標(biāo)本為同濟(jì)醫(yī)院眼庫排除眼部疾患的捐獻(xiàn)者的眼球，于死后24h內(nèi)取材。主要試劑：LipofectamineTM 2000 (Invitrogen公司)；pEGFPN1(美國(guó)ClonTech公司)；DMEM

7、/F12培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?博大泰克公司)。1.2方法 取材與細(xì)胞培養(yǎng)：眼球在無菌條件下，沿角鞏膜緣后5mm處剪開眼球，將眼前段倒置于手術(shù)臺(tái)上，暴露出房角結(jié)構(gòu)，用刀片小心分離表面的小梁組織，用顯微鑷子夾出，分成小塊后接踵于培養(yǎng)瓶里，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1wk內(nèi)不用換液，讓組織塊穩(wěn)定并適應(yīng)環(huán)境，1wk以后換液，1次/wk，細(xì)胞開始長(zhǎng)出后2次/wk。細(xì)胞基本覆蓋瓶底時(shí)用胰酶消化法傳代，如此直到第3代(圖1)。pEGFPN1質(zhì)粒制備：pEGFPN1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,卡那霉素(50g/mL) 篩選陽性菌落,LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),用質(zhì)粒提取試劑盒提取pEGFP

8、N1基因。所得質(zhì)粒A260/A280為1.812 ,含量為0.51.5g/L。LipofectamineTM2000/pEGFPN1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人小梁細(xì)胞：取第34代細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前分別將1×105個(gè)小梁細(xì)胞分別接種于3個(gè)直徑為35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞生長(zhǎng)至70%80%融合。轉(zhuǎn)染前用無血清OptiMEM洗滌細(xì)胞兩次，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的操作說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取2g質(zhì)粒DNA溶于250L的OptiMEM培養(yǎng)基中 ，分別加入含有4，6，8L的OptiMEM，將質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體輕輕混勻后室溫下靜置20min。使脂質(zhì)體充分包裹，然后均勻加入細(xì)胞中，37孵育5h。吸去培養(yǎng)基后加入等體

9、積含100mL/L血清不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，然后用2.5g/L胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，重懸于PBS 中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP 陽性細(xì)胞的百分率。2結(jié)果    Lipofectamine TM2000介導(dǎo)pEGFPN1質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小梁細(xì)胞24h后，在熒光顯微鏡下用藍(lán)色光為激發(fā)光,可觀察到20%30%的小梁細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)（圖2）, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)同樣可見經(jīng)pEGFPN1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中約有20%30%表達(dá)GFP 。在細(xì)胞融合度相同，每孔2g質(zhì)粒DNA量為2g 時(shí)，按照DNA脂質(zhì)體為12，13，14的比率進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，各

10、組轉(zhuǎn)染效率差別（圖3），在DNA脂質(zhì)體為13時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高。顯微鏡下見4L脂質(zhì)體及6L脂質(zhì)體組細(xì)胞存活狀態(tài)較好,而8L脂質(zhì)體組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，細(xì)胞膜變的不清楚，顯示細(xì)胞狀態(tài)不佳，甚至可見較多的細(xì)胞脫落或死亡。3討論    脂質(zhì)體導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的機(jī)制及特點(diǎn)：脂質(zhì)體介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞的原理,是通過包繞DNA ,共縮合成脂囊, 與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合,經(jīng)細(xì)胞的胞飲或受體介導(dǎo)的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在脂質(zhì)體的磷脂成分中加入帶有正電荷的磷脂分子,使其外部帶正電荷,由于細(xì)胞膜及DNA 分子都帶負(fù)電荷,故用陽離子脂質(zhì)體作為基因的載體,既有利于包裹DNA 分

11、子,也使脂質(zhì)體易與細(xì)胞膜融合24。陽離子脂質(zhì)體用于小梁細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的安全性：一種基因轉(zhuǎn)染載體能否應(yīng)用與臨床，首先取決于其安全性。許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明陽離子脂質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞很少或沒有影響，反復(fù)應(yīng)用也不會(huì)引起免疫反應(yīng)5，然而，有些研究報(bào)道了高濃度的脂質(zhì)體可以對(duì)細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞活性產(chǎn)生不利影響，這些影響與脂質(zhì)體的化學(xué)構(gòu)成有關(guān)，過高濃度的脂質(zhì)體能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的各種酶的代謝產(chǎn)生不利影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡6,7。同時(shí)不同組織來源的細(xì)胞也存在耐受性的差異，不同種類的陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性也存在較大差異。脂質(zhì)體與DNA的比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響：由于轉(zhuǎn)染時(shí)脂質(zhì)體與DNA是形成小單層脂質(zhì)體包裹DNA的復(fù)合物，給

12、予適當(dāng)比例的脂質(zhì)體/DNA可以使得脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物穩(wěn)定，增加復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞的效率。而脂質(zhì)體與DNA的比例不當(dāng)，使得無效的脂質(zhì)體增加，同時(shí)游離的DNA分子會(huì)影響脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性。而游離的脂質(zhì)體則可增加細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞的代謝發(fā)生影響，使細(xì)胞表達(dá)外源基因受到影響，最終降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。    本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)的人小梁細(xì)胞為外源基因轉(zhuǎn)移對(duì)象,采用脂質(zhì)體為介導(dǎo)體，pEGFPN1含有編碼綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的cDNA，用作報(bào)告基因以評(píng)價(jià)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)水平。pEGFPN1的啟動(dòng)子來源于人巨細(xì)胞病

13、毒即早抗原基因調(diào)控順序,能啟動(dòng)下游的目的基因在各種真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí), 陽離子脂質(zhì)體載體LipofectamineTM2000能有效的將外源基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)小梁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到20%30%，但脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物比例必須控制在合適的范圍之內(nèi)，比例過高或過低都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。    總之，陽離子脂質(zhì)體能有效介導(dǎo)質(zhì)粒攜帶的外源基因在小梁細(xì)胞的表達(dá)，當(dāng)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物比例時(shí)可以達(dá)到相當(dāng)高的效率而不引起明顯的細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)體作為一種應(yīng)用方便、無細(xì)胞毒性、無免疫原性的基因治療載體，有望在小梁細(xì)胞的基因治療中發(fā)揮重要作用。  &#

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