第五章 抗體的制備

1、第五章 抗體的制備 1975年Kohler和Milstein首先報道用細胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，建立起第一個細胞雜交瘤細胞株，并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。迄今全世界已研制成數(shù)以千的McAb。 單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易，所以一問世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學領(lǐng)域中，McAb在診斷疾病、判斷預后、防治疾病以及疾病機制研究等方面起著巨大的促進作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲諾貝爾醫(yī)學獎。 第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理

2、 雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長（選擇原理見后），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂“永生”性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列幾個主要步驟闡明。 （一）細胞的選擇與融合 建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是細胞聚集的

3、重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是細胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細胞融合伴侶。目前常用的細胞瘤株有：P3-X63-Ag8（Kohlerand Milstein,1975）,P3-NSI/1-Ag4-1（Kohler and Milstein,1976），X63-Ag8.653（Kearney et al,1979），Sp2/0-Ag14（Schulman et al,1978）等，這些細胞株皆為HAT敏感細胞株。 使用細胞融合劑造

4、成細胞膜一定程度的損傷，使細胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（PEG 10002000）是目前最常用的細胞融合劑，一般應用濃度為40（W/V）。 （二）選擇培養(yǎng)基的應用 細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸液中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)，如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅57天，無需特別篩選 ，細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。 細胞的DNA合成一

5、般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成份：次黃嘌呤（hypoxanthine,H）、氨甲喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲喋呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT- 細胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細胞具有親代雙方

6、的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖。 （三）有限稀釋與抗原特異性選擇 在動物免疫中，應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應答，實質(zhì)是眾多細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程，在已經(jīng)融合的細胞中，有相當比例的無關(guān)細胞的融合體，需經(jīng)篩選去除。篩選過程一般分兩步進行：一是融合細胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間（30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性細胞；這

7、一過程常被習慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再行克隆化，應用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。 第二節(jié) 制備單克隆抗體的基本技術(shù) 制備單克隆抗體是復雜而費時的工作，整個技術(shù)流程如圖5-2。 動物免疫 ELISA法測定抗血清 分離脾細胞 制備骨髓瘤細胞 飼養(yǎng)細胞 細胞融合 HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞 陽性孔克隆化并擴大培養(yǎng) 細胞凍存 飼養(yǎng)細胞 再次克隆化 克隆擴大培養(yǎng) 細胞凍存 擴大培養(yǎng)收集上清 動物接種收集腹水 單克隆抗體純化保存 圖5-2 雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的線路流程 （一）抗原提純與動物免疫 對抗原的要求是純度越高越

8、好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原，可取1107 個細胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖杓油耆Ｊ献魟┎⒔?jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。 選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/C健康小鼠，鼠齡在812周，雌雄不限。為避免小鼠反應不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫34只小鼠。 免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般23周。一般來說，被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產(chǎn)生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親合力）也與免疫過程中

9、小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。末次免疫后34天，分離脾細胞融合。 （二）骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備 選擇瘤細胞株的最重要的一點是與待融合的細胞同源。如待融合的是脾細胞，第一節(jié)中所述各種骨髓瘤細胞株均可應用，但應用最多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的最高生長密度為9105 /ml，倍增時間通常為1015小時。融合細胞應選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性俱佳的細胞（活性應大于95%）。骨髓瘤細胞株在融合前應先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應培養(yǎng)，在細胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為2105 /ml，次日一般即為對數(shù)

10、生長期細胞。 在體外培養(yǎng)條件下，細胞的生長依賴適當?shù)募毎芏?，因而，在培養(yǎng)融合細胞或細胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細胞（feedercells ）。常用的飼養(yǎng)細胞為小鼠的腹腔細胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞，其中有巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為飼養(yǎng)細胞的。par 在制備飼養(yǎng)細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重污染。飼養(yǎng)細胞調(diào)至1105 /ml，提前一天或當天置板孔中培養(yǎng)。 （三）細胞融合 細胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后以培養(yǎng)液

11、稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有幾個問題應特別注意。細胞比例 骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例，應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。反應時間 在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2分鐘滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。培養(yǎng)液的成份 對融合細胞而言，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應隨時核查培養(yǎng)基情況。 （四）有限稀釋法 篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT 敏感細胞株，所以只有融合的細胞才能持續(xù)存活一周以上。融合細胞呈

12、克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個細胞 /孔），按Poisson法計算，應有36%的孔為1個細胞/孔。細胞培養(yǎng)至覆蓋10%20%孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養(yǎng)或凍存。 （五）單克隆抗體的制備和凍存 篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染色體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆

13、抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/C小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集510ml的腹水,有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細胞的數(shù)量應適當，一般為5105 鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當增減。 選出的陽性細胞株應及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在-70冰箱則活性改變較快。細胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應用的凍存保護劑。凍存細胞復蘇后的活性多在50%95%之間。如果低于50%，則說明凍存復蘇過程有問題。 （六）單克隆抗體的純化 單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水中特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果較好。按所要求的純度不同采用相應的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的，也有采用較簡便的酸沉淀方法。目前最有效的