養(yǎng)肝利膽顆粒治療膽囊炎作用機(jī)理研究

1、養(yǎng)肝利膽顆粒治療膽囊炎作用機(jī)理研究                     作者：高建平，金若敏，朱培庭，吳耀平，沈偉，陳艷艷 【摘要】  目的觀察養(yǎng)肝利膽顆粒的溶石和抗菌作用。方法采用體外溶石實(shí)驗(yàn)觀察該藥的溶石作用；采用豚鼠膽色素結(jié)石模型觀察口服養(yǎng)肝利膽顆粒對(duì)動(dòng)物的成石率和膽汁成分的影響；采用體外試管法研究藥物的直接抑菌作用以及含藥血清和含藥膽汁的抑菌作用。結(jié)果養(yǎng)肝

2、利膽顆粒體外能溶解膽色素型、膽固醇型和混合型結(jié)石;體內(nèi)能降低模型豚鼠的成石率，升高膽汁中總膽汁酸的量，降低總膽紅素和游離膽紅素含量；藥物對(duì)痢疾桿菌、變形桿菌、大腸桿菌等有直接抑制作用；含藥血清和含藥膽汁對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌等有較強(qiáng)的抑菌作用。結(jié)論養(yǎng)肝利膽顆粒膽囊炎主要的作用機(jī)理是其具有溶石和抗菌作用。 【關(guān)鍵詞】  養(yǎng)肝利膽顆粒； 膽囊炎； 溶石； 抗菌； 作用機(jī)理Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Yang-Gan-Li-Dan Granule  (YGLDG) on litholysis and bacterio

3、stasis. MethodsThe effect of the granule on litholysis was tested in vitro. The model of bile pigment calculus in guinea pigs was established,and the effect of the granule on anti-lithogenesis and on bile components was also observed in vitro. By adding the granule dilution, the drug contained serum

4、 and bile, which were prepared from the rats given the granule per os, directly into the culture medium, the anti-bacteria effect of the granule was evaluated.ResultsIn vitro, YGLDG solution could increase the litholytic effect on human bile pigment calculus, chelecsterol calculus and combined calcu

5、lus. In vitro, it could inhibit lithogenesis in guinea pigs, elevate the level of total bile acid and reduce the levels of total and free bilirubin. In vitro, YGLDG showed the bacteriostatic effect for Bacillus dysteriae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus etc. The drug-contained serum and bile

6、 had the obvious bacteriostatic effect on Escherichia coli, Bacillus dysteriae etc.ConclusionThe results show that the main mechanisms of YGLDG on treating cholecystitis are related to its effects on litholysis and bacteriostasis.Key words:Yang-Gan-Li-Dan Granule (YGLDG);   Cholecystitis;&

7、#160;  Litholysis;   Bacteriostasis;   Mechanism    膽囊炎是膽道系統(tǒng)常見疾病，其發(fā)生和的主要原因多與膽囊結(jié)石和細(xì)菌感染等有關(guān)13。養(yǎng)肝利膽方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華名中醫(yī)朱培庭教授多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要由白芍、首烏等中藥組成，適用于屬于肝陰不足之證的膽道感染和膽石癥。臨床實(shí)驗(yàn)顯示該方對(duì)于膽囊炎和膽石癥治療的總有效率達(dá)90%以上4。已有研究證實(shí)養(yǎng)肝利膽顆粒具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙以及保肝利膽等作用5，6，證明該方對(duì)膽囊炎的常見臨床癥狀和病理生理異常具有改善作用。為進(jìn)一步

8、探討其治療膽囊炎的作用機(jī)理，筆者對(duì)養(yǎng)肝利膽顆粒溶石防石和抗菌等作用進(jìn)行了研究。結(jié)果報(bào)道如下。1  材料與儀器1.1  試劑和藥物 養(yǎng)肝利膽顆粒（干膏粉），四川美大康藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)020301。每克干膏粉相當(dāng)于4 g生藥（以下簡(jiǎn)稱養(yǎng)肝利膽）。膽寧片，上海中藥制藥一廠生產(chǎn)，批號(hào)000715。熊去氧膽酸片，上海黃河利亞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)000101。頭孢他啶，粉針劑，ELI LILLY DO BRASIL LTDA.生產(chǎn)，批號(hào)100600C。各藥物用蒸餾水配制成相應(yīng)的濃度備用。烏拉坦，醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)C20021104。1.2

9、60; 儀器  BTR-815型生化分析儀，西班牙臨床診斷有限公司產(chǎn)品。微量分光光度儀（酶標(biāo)儀），美國(guó)MD 250型。1.3  動(dòng)物 Wistar大鼠，體重200300 g；豚鼠，體重250320 g，雌雄皆用，均由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)分別為醫(yī)動(dòng)字02-24-4號(hào)和20-60號(hào)。1.4  其他 膽色素型、膽固醇型、混合型人體結(jié)石，均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供。50 g致石飼料（自制）中，含正常飼料45.43 g，致石性藥物4.57 g(其中有酪蛋白1 g，蔗糖1.5 g，豬油1 g，微晶纖維素1 g，膽酸0.02 g，

10、膽固醇0.05 g)；正常飼料由上海申旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，變形桿菌，綠膿桿菌，痢疾桿菌，溶血性鏈球菌，糞鏈球菌，肺炎桿菌，由上海市防疫站和衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，血清肉湯培養(yǎng)基，血清瓊脂培養(yǎng)基，由上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物教研室自制。2 方法2.1 溶石2.1.1  體外溶石作用7   取人膽色素型、膽固醇型和混合型3種結(jié)石，洗凈，80恒溫干燥24 h，稱取100101 mg（W1）結(jié)石裝入含有經(jīng)60Co輻照滅菌的藥物或生理鹽水10 ml的小瓶?jī)?nèi)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，養(yǎng)肝利膽大、小劑量組，膽寧片

11、組和熊去氧膽酸組。將小瓶置于37恒溫箱中，每?jī)商鞜o菌操作換藥液或生理鹽水1次，共30 d，末次換藥或生理鹽水后48 h取出結(jié)石，沖洗干凈后同前法烘干，稱重（W2），溶石率。    溶石率（%）=W1-W2W1×100%2.1.2 體內(nèi)溶石作用  取健康豚鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，養(yǎng)肝利膽大、中、小劑量組和膽寧片組。除正常對(duì)照組動(dòng)物每天喂以正常飼料外，其它各組動(dòng)物均喂以致石飼料制備豚鼠膽色素結(jié)石模型8。同時(shí)各組動(dòng)物分別灌服生理鹽水或不同藥物（見表2）10 ml/kg，1次/d，連續(xù)6周。末次給生理鹽水或藥物24 h后，稱鼠體重

12、，各鼠腹腔注射25%烏拉坦麻醉，剖開膽囊觀測(cè)其成石情況，同時(shí)取膽汁作膽汁成分檢測(cè)。2.2  抑菌2.2.1 體外直接抑菌作用9將養(yǎng)肝利膽、膽寧片分別用生理鹽水溶解稀釋至200 mg/ml，再加等量的營(yíng)養(yǎng)肉湯或血清肉湯，經(jīng)11530 min消毒滅菌。采用試管稀釋法，用微量加樣器取制備好的菌液0.1 ml(相當(dāng)于108CFU/ml)加至已對(duì)倍稀釋的各受試試管中（各管樣品的稀釋度為12，14，18，116，132，164，1128，1256），同時(shí)設(shè)肉湯對(duì)照管和待測(cè)藥物原液對(duì)照管。將試管置35孵育48 h后觀測(cè)結(jié)果，求MIC。2.2.2 體外藥物血清抑菌作用  

13、0;      含藥血清的制備：取健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、養(yǎng)肝利膽組、頭孢他啶組。前兩組分別灌胃給予蒸餾水或養(yǎng)肝利膽28.8 g生藥/（kg·d），每次給藥容量為9 ml/kg，2次/d，連續(xù)7次。末次給蒸餾水或藥后1.5 h，腹腔注射25%烏拉坦麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血；頭孢他啶（1.8 g/kg）組腹腔注射給藥，給藥容量為4.5 ml/kg，30 min后，同法取血。離心分離血清，置于56水浴中滅活30 min，備用。   體外抑菌作用  ：將裝有1 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯試管分為4組，依次為正常對(duì)照組、

14、養(yǎng)肝利膽組、頭孢他啶組和空白對(duì)照組，分別加入空白血清、含養(yǎng)肝利膽血清、含頭孢他啶血清和營(yíng)養(yǎng)肉湯各1 ml。按“2.2.1”方法將各菌液接種至各試管中，將試管置35孵育，分別于0，6，12 h和24 h后取出，參照9用分光光度儀在波長(zhǎng)590 nm下測(cè)定其OD值。2.2.3 含藥物膽汁抑菌作用       含藥膽汁的制備：取健康豚鼠，分組和給藥量同“2.2.2”項(xiàng)中“含藥血清的制備”項(xiàng)下，前兩組分別灌胃給予蒸餾水或養(yǎng)肝利膽，2次/d，連續(xù)8次，末次給蒸餾水或藥后2 h，腹腔注射25%烏拉坦麻醉動(dòng)物，從膽囊中抽取膽汁；頭孢他啶組腹腔注射給藥

15、1次，1.5 h后，同法取膽汁，并將膽汁按18比例稀釋備用。    體外抑菌作用：取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將加入100  l營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔分為4組，依次為正常對(duì)照組、養(yǎng)肝利膽組、頭孢他啶組和空白對(duì)照組，分別加入空白膽汁、含養(yǎng)肝利膽膽汁、含頭孢他啶膽汁和營(yíng)養(yǎng)肉湯各100 l。取制備好的菌液(相當(dāng)108CFU/ml)，稀釋成1100濃度，用微量加樣器分別取100 l檢測(cè)菌液加至各孔中，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置35孵育，分別于0，8，24 h后取出，參照文獻(xiàn)9，用分光光度儀在波長(zhǎng)590 nm下測(cè)定其OD值。1     &

16、#160;   2.3  統(tǒng)計(jì)方法   實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，計(jì)量資料用±s表示；兩組間比較用t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用四格表精確檢驗(yàn)法檢驗(yàn)。3  結(jié)果3.1  溶石3.1.1  體外溶石作用    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示養(yǎng)肝利膽顆粒對(duì)3種人體結(jié)石均有顯著的溶石作用，膽寧片與熊去氧膽酸亦有明顯的溶石作用。結(jié)果見表1。表1  養(yǎng)肝利膽顆粒對(duì)各類結(jié)石溶石率的影響(略)3.1.2 體內(nèi)溶石作用 結(jié)果顯示模型組動(dòng)物體重減輕，成石率明顯升高，膽汁

17、成分中，總膽汁酸含量降低，總膽紅素和游離膽紅素升高，則膽結(jié)石模型成功。養(yǎng)肝利膽和膽寧片組動(dòng)物健康狀況良好,體重生長(zhǎng)正常，兩者均可明顯降低模型動(dòng)物的成石率，升高模型動(dòng)物膽汁中總膽汁酸，降低總膽紅素和游離膽紅素的異常升高。與模型組比較，差異顯著，表明藥物均有預(yù)防結(jié)石形成的作用。結(jié)果見表23。表2  養(yǎng)肝利膽顆粒對(duì)豚鼠膽囊成石率及體重的影響(略)表3   養(yǎng)肝利膽顆粒對(duì)豚鼠膽汁成分的影響(略)3.2  抑菌3.2.1  體外直接抑菌作用  實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示養(yǎng)肝利膽顆粒有一定的抑菌作用，對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、變形桿菌作用較對(duì)其他受試菌作

18、用強(qiáng)，膽寧片也有一定抑菌作用。結(jié)果見表4。表4   養(yǎng)肝利膽顆粒體外抗菌活性(略)3.2.2  體外藥物血清抗菌作用   結(jié)果顯示，含藥血清均能降低細(xì)菌培養(yǎng)液的OD值，表明養(yǎng)肝利膽顆粒有一定的抗菌作用，其中對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌作用較對(duì)其他受試菌作用強(qiáng)，頭孢他啶對(duì)4種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌作用。結(jié)果見圖14。    細(xì)菌增長(zhǎng)率（%）=OD值n小時(shí)-OD值0小時(shí)OD值0小時(shí)× 100%3.2.3  含藥膽汁體外抑菌作用   結(jié)果顯示含養(yǎng)肝利膽或頭孢他啶的

19、膽汁均能降低大腸桿菌、葡萄球菌、痢疾桿菌培養(yǎng)液的OD值，表明有一定的抗菌作用。結(jié)果見圖58。4  討論    膽囊炎的發(fā)病原因主要從膽囊排空受阻開始，包括結(jié)石機(jī)械損傷，膽汁淤積引發(fā)膽囊內(nèi)高壓、代謝障礙、細(xì)菌感染及神經(jīng)因素等，其中結(jié)石造成膽囊管梗阻是最常見的病因1，2。另外膽囊炎和膽囊結(jié)石兩者往往互有聯(lián)系互為因果，膽囊炎的主要類型為結(jié)石性膽囊炎，而膽囊結(jié)石通常又有炎癥的表現(xiàn)13。因此對(duì)結(jié)石性膽囊炎的，溶石是其主要措施之一。    膽汁是由肝臟分泌的一種復(fù)雜液體，含有膽固醇、膽汁酸、磷脂、膽紅素等成分。正常情況下這些物質(zhì)可以溶解

20、于膽汁中，但是在不正常條件下，膽汁中的部分成分變成不溶性的物質(zhì)并形成沉淀，如膽紅素含量增高，特別是游離膽紅素可與鈣結(jié)合成不溶性膽紅素鈣析出，如果沉淀不斷形成，沉淀復(fù)合物長(zhǎng)大，將最終生成膽色素結(jié)石。膽汁中膽汁酸是其重要成分，它占膽汁干重的85%左右。膽汁酸是膽紅素、膽固醇等物質(zhì)的助溶劑，因此膽汁成分中，膽汁酸和膽紅素的變化與膽色素結(jié)石密切相關(guān)。    本研究中，采用體外溶石的方法，可以直接觀察藥物對(duì)于各種結(jié)石的溶解作用。結(jié)果表明養(yǎng)肝利膽顆粒能溶解膽色素型、膽固醇型和混合型結(jié)石，其中溶解膽色素型結(jié)石作用較強(qiáng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用低蛋白飲食導(dǎo)致動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)不良，肝細(xì)胞濁腫變性的

21、同時(shí)，甘氨酸、膽固醇等原料供應(yīng)不足，致使肝臟合成膽汁酸的量減少，膽紅素體內(nèi)代謝異常，造成膽紅素溶解度下降從而形成膽色素結(jié)石動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)中以動(dòng)物結(jié)石率以及膽汁中的膽汁酸和膽紅素的變化為指標(biāo)來觀察藥物的作用。結(jié)果證實(shí)該藥能明顯降低模型動(dòng)物的成石率，與體外溶石結(jié)果一致，可降低膽汁中總膽紅素、游離膽紅素及其百分比，升高膽汁中總膽汁酸，證實(shí)了該方可抑制膽石形成。    細(xì)菌感染是膽囊炎的主要致病因素之一。細(xì)菌感染的發(fā)生和部分原因是由膽結(jié)石造成膽囊管阻塞引起膽汁淤滯，加上組織損傷及化學(xué)炎癥導(dǎo)致黏膜抵抗力下降。膽囊炎發(fā)作時(shí)膽囊內(nèi)膽汁的細(xì)菌培養(yǎng)陽性率高達(dá)80%90%，其中腸源性革蘭氏陰性桿菌為最常見的致病菌。細(xì)菌在酶的作用下使結(jié)合膽汁酸轉(zhuǎn)變成有毒的游離膽汁酸，也可加重組織損傷和炎癥2。    采用體外試管法，將藥物直接加入被檢細(xì)菌培養(yǎng)液中，可測(cè)定藥物對(duì)細(xì)菌的直接作用。根據(jù)液體中細(xì)菌數(shù)量與其吸光度呈正比的原理，采用比色法，將含藥血清或含藥膽汁加入被檢細(xì)菌培養(yǎng)液中，經(jīng)不同時(shí)間培養(yǎng)后，用分光光度儀測(cè)定其培養(yǎng)物吸光度的變化，來反映含藥血清或者含藥膽汁對(duì)細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果證實(shí)養(yǎng)肝利膽顆粒對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等均有一定的抗菌作用。本研究中采用膽汁進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，該方法