植物總RNA的提取及RT

1、植物總RNA的提取及 RT-PCR一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)從植物組織中提取總RNA的方法2. 了解RT-PCR的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法二、實(shí)驗(yàn)原理1. RNA提取的原理RNA是一類(lèi)極易降解的分子， 要得到完整的 RNA，必須最大限度地抑制提取過(guò)程中 內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對(duì)RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)時(shí)不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過(guò)酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。2. RT-PCR的原理提取組織或細(xì)胞中的總 RNA，以其中的mRNA作為模板，采用

2、Oligo（dT）作引 物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因或 檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因和合成cDNA探針等。（一）儀器及器皿1 .低溫離心機(jī);4. PCR 儀；7.離心管；三、儀器、藥品與試劑配方3.高壓滅菌鍋；6. 一次性手套等；9.燒杯及試劑瓶等。2 .瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng);5.研缽；8.培養(yǎng)皿；1.4.焦碳酸二乙酯（DEPC）苯酚2.異硫氰酸胍（GT）3.醋酸鈉（NaAc）6.氯仿5.異丙醇7.乙醇8.3 巰基乙醇9.瓊脂

3、糖10.MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒11.Taq DNA聚合酶12.引物（三1）試劑配制1 .0.1% DEPC水火菌2.4 mol/L異硫氰酸胍3.2 mol/L NaAc(pH 4.8 )火菌4.3 mol/L NaAc(pH 4.8 )火菌5.4 mol/L LiCl火菌6.1 XTE緩沖液:10 mM Tris-HCl (pH8.0 ), 1mM EDTA ( pH8.0)（二）藥品,滅菌。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 總RNA的提?。?） 研缽冷卻后，倒入2/3液氮，加入0.2 g植物材料，充分研磨后轉(zhuǎn)入一個(gè)含有300 Jl的4M GT的1.5 ml的聚丙烯管中，搖勻。（2）加入 30 Jl 2 M N

4、aAc （pH4.9-5.2）搖勻，加入 300 Jl 酸酚（水飽和酚 pH<5.0）, 搖勻，加入100三氯甲烷，搖勻。(3) 12000 rpm 4 C離心20 min，吸取上清，加入等體積異丙醇，于冰上放置15 min。(4) 12000 rpm 4 C離心10 min，將沉淀懸浮于含 100川4M氯化鋰的1.5 ml EP管 中，于-20 C放置1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。(5) 12000 rpm 4 C離心10-15 min，將沉淀溶于 0.4 ml DEPC 水中，加入1/2體積氯仿和1/2體積酸酚，搖勻，進(jìn)行抽提，12000 rpm 4 C離心5 min ;上清加入等體積氯仿，搖勻

5、，進(jìn)行抽提，12000 rpm 4 C離心5 min。(6) 上清液加入1/10體積的3 M乙酸鈉和兩倍體積的無(wú)水乙醇于-20 C放置1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。(7) 12000 rpm 4C離心15 min，超凈臺(tái)吹干，沉淀溶于 10川b滅菌的DEPC水中。(8) RNA 貯于-80 C。(二) RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA在DEPC處理過(guò)的離心管中 冰上按下表加入：模板RNAOlig(dT) 18DEPC水2 p1 p2p混勻，70 C水浴中放置 2 min，立即放置到冰上2 min。然后在冰上依次加入RNasi n0.5 plM- MLV1 p5 x buffer2 p10 mM dNTP1.5 p

6、42C，水浴中反應(yīng) 90 min。 72C, 10 min，終止反應(yīng)。 加入15 p的DEPC滅菌水，使總體積達(dá)到 25 p。(三)PCR1. 在滅菌的PCR管中加入以下成分，形成 PCR反應(yīng)體系10 X buffer2.5 pdNTP (2.5 mmol) 2p lRT-PCR產(chǎn)物5 pTaq 酶0.5p上游引物(10 p mol/l )0.5訕下游引物(10 p mol/l )0.5訕滅菌ddH2O加到25 p2. 按照下列條件進(jìn)行 PCR反應(yīng)94 C5 min94C30s55 C30s72 C1 min30個(gè)循環(huán)72 C7 min4 C(四)電泳檢測(cè)將加EB的1 %變性瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加1XTE電泳緩沖液，覆蓋凝膠約1 mm。將RNA及DNA樣品加到凝膠點(diǎn)樣孔中， 85 V條件下電泳30 min，在紫 外燈下觀察結(jié)果。五、注意事項(xiàng)1在研磨過(guò)程中，利用液氮時(shí)刻使組織保持冰凍狀態(tài)。2 . RNA酶是一類(lèi)生物活性非常穩(wěn)定的酶類(lèi)，除了細(xì)胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時(shí)應(yīng)戴手套。3. 使用DEPC時(shí)，應(yīng)在通風(fēng)櫥中戴手套操作。4RNA 提取用品準(zhǔn)備：1） 普通的玻璃器皿：180 C烘干8小時(shí)（玻璃），研缽，小勺，試劑瓶若干個(gè)。2）一次性使用的塑料制品：槍頭、 EP管等先用DEPC水處理然后高壓滅菌，烘干。3 ）電泳槽：去污劑洗干凈，水沖洗，3