模式植物擬南芥T

1、姓名系年級學(xué)號 日期科目遺傳學(xué)實驗題目模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定摘要：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，在獲得的后代分離群體中，有 T-DNA插入 的純合突變體，雜合突變體，和野生型。在突變體研究中，需要的材料是純合突 變體。本次實驗意在對模式植物擬南芥 T-DNA插入突變體進行鑒定。實驗中用到 的主要實驗方法有：CTABt提取擬南芥基因組DNA PCRT增目的基因片段、瓊 脂糖凝膠電泳分離核酸。PCF技術(shù)的基本原理類似于 DNA的天然復(fù)制過程。PCR由變性-退火-延伸 三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。每完成一個循環(huán)需 24分鐘，23小時就能將待擴增 目

2、的基因擴增放大幾百萬倍。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。DNA經(jīng)EB染色，EB可與核酸結(jié)合，在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生熒光?，F(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。引言Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，該質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，該 DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移進植物細(xì)胞，并插入植物染色體 DNA中。所以Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的 DNA被叫做T-DNA將Ti質(zhì)粒進行改 造，將感興趣的基因放進T-DNA區(qū)段中，通過農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，實現(xiàn)外源基 因?qū)χ参?/p>

3、的遺傳轉(zhuǎn)化。T-DNA插入基因內(nèi)部導(dǎo)致基因突變：T-DNA插入到植物染色體上的位置是隨 機的。如果T-DNA插入進某個功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成 基因功能的喪失。所以利用農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的 一種重要方法。農(nóng)桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。這使農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用范圍受到了一定 的限制。反向遺傳學(xué)研究的首要條件是獲得基因敲出突變體，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突變體的鑒定方法。其中，三引物法”是主要鑒定方法之一。三引物法”即采用三個引物（LP、RP BP）進行PCR擴增。野生型植株目的

4、 基因的兩條染色體上均未發(fā)生 T-DNA插入，所以其PCR擴增產(chǎn)物僅有1種，電 泳結(jié)果為一條大帶（由LP+RP這一對引物擴增出來）；純合突變體植株目的基因 的兩條染色體上均發(fā)生T-DNA插入，也只能得到1種PCR擴增產(chǎn)物，電泳結(jié)果 為一條小帶（由BP+RP這一對引物擴增出來）；雜合突變體植株只在目的基因的 一條染色體上發(fā)生了 T-DNA插入，所以PCR擴增產(chǎn)物有2種，電泳結(jié)果為一條 大帶由（LP+RP這一對引物擴增出來）和一條小帶（由 BP+RP這一對引物擴增出 來）。電泳結(jié)果差異明顯，能有效區(qū)插入突變體的類型。此法優(yōu)點是可同時鑒定出純合突變體并確證 T-DNA的插入情況。本方法操作 簡單，成

5、功率高，結(jié)果可靠，適用于從大量擬南芥 TDNA插入突變體中快速鑒 定出突變體?！緦嶒灢牧稀?試劑：液氮，2*CTAB提取液，氯仿-異戊醇（24： 1），無水乙醇，70%乙醇，TE, PCR反應(yīng)體系（DNA模板（基因組DNA），引物L(fēng)P、RP、BP,緩沖液，MgC2, dNTP mixture, ddHzO, Taq酶），瓊脂糖凝膠電泳（瓊脂糖，1 x TAE緩沖液，Loading buffer, DL 2,000 DNA Marke,入-Hind 川 DNA digest Marker,溴化乙錠。2. 器具：1.5ml離心管，水浴鍋，微量移液器，離心機，PCR儀，微波爐，電泳儀，電泳槽，梳子，

6、三角瓶，微量天平，手套，染色盤，凝膠成像儀。3. 材料：擬南芥T-DNA插入突變體植株?！緦嶒灢襟E】提取擬南芥基因組DNA1. 在1.5ml離心管中放入2或3片擬南芥幼嫩葉片，用液氮將其研磨成細(xì)粉，向 管中加入600ul預(yù)熱至65C的2X CTAB提取液，輕搖混勻。2. 65C水浴30 min,其間輕搖混勻。3. 向上清液加入等體積的氯仿/異戊醇（24: 1）,室溫下輕輕混勻10 min, 12000 rpm離心15 min,再轉(zhuǎn)移上清入新管。4. 向上清液中2倍無水乙醇或等體積的異丙醇，小心混勻，-20 C下30 min, 12000 rpm離心15 min,棄上清。5. 用70%乙醇洗滌沉

7、淀一次，12000 rpm稍離心，棄上清。6. 將沉淀晾干，加 20-50ul TE （pH 8.0） 65C水浴 30 min 溶解 DNA。PCR取3個PCR小管（一個為三引物體系，另外兩個為雙引物體系），按照如下 反應(yīng)體系向PCR小管內(nèi)加入樣品，設(shè)定如下反應(yīng)程序，進行 PCR 反應(yīng)體系：三引物反應(yīng)體系25ul體系雙引物反應(yīng)體系25ul體系出015ulH2O16ul10xTaq buffer (MgCbfree)2.5ul10xTaq buffer (MgCbfree)2.5ulMgCb (25mM)2ulMgCb (25mM)2ul引物 LP (10 uM)1ul引物 LP或 BP (1

8、0 uM)1ul引物 RP (10 uM)1ul引物 RP(10 uM)1ul引物 BP (10 uM)1uldNTP 各 2.5mM)0.5uldNTP 各 2.5mM)0.5ul模板 DNA(30-50ng/ 口 l)2ul模板 DNA(30-50ng/ 口 l)2ulTaq 酶(5U/ 口 l )0.2ulTaq 酶(5U/ 口 l )0.2ul反應(yīng)程序預(yù)變性94 C5min變性94 C40sec退火53 C50sec延伸72 C80sec循環(huán)35次72°C10mi n瓊脂糖凝膠電泳注：電泳這一步驟，我與其余五名同學(xué)共同完成，共用同一塊膠板?；蚪MDNA的電泳所用瓊脂糖凝膠濃度

9、為0.8%, PCR產(chǎn)物的電泳所用瓊 脂糖凝膠濃度為2%。1. 制膠：稱取0.24g瓊脂糖，加入30mlTAE緩沖液（用于基因組DNA的電泳）；另稱取1.60g瓊脂糖，加入80mlTAE緩沖液（用于PCR產(chǎn)物的電泳）。 放入微波爐中加熱溶化。2. 灌膠：待膠冷至50-60C時，緩緩倒入膠板。約半個3040min后，膠已凝固,拔去梳子，將膠板放在電泳槽中，補充槽內(nèi) TAE緩沖液，至約高出膠板 1mm。3. 加樣：將樣品與Loading buffer在封口膜上混勻，用微量移液器將樣品加入到點樣孔內(nèi)。（基因組DNA加樣量為5ul，PCR產(chǎn)物加樣量為20ul）4. 電泳：接通導(dǎo)線（加樣端接負(fù)極），調(diào)節(jié)

10、電壓至5v/cm，當(dāng)指示劑距膠板底部1-2cm時，停止電泳。5. 染色：將膠板放入含EB的染色盤中，染色約10min，再將膠板轉(zhuǎn)移到清水中清洗。6. 觀察：將凝膠放入凝膠成像儀內(nèi)觀察、拍照?！緦嶒灲Y(jié)果】理論上，電泳結(jié)果圖上會出現(xiàn)一條大帶或一條小帶或兩條帶同時出現(xiàn)，并且可以對T-DNA插入突變體的類型做出準(zhǔn)確鑒定。各種可能的電泳結(jié)果對應(yīng)插入突 變的類型如下表：電泳條帶的有無鑒定結(jié)果1000-1500bp 間800-900bp 間有無野牛型有有插入雜合突變體無有插入純合突變體但是由于多種可能，最終基因組DNA和PCFT增產(chǎn)物的電泳結(jié)果都沒有出現(xiàn) 預(yù)期條帶。對這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因分析如下：由于班里大多數(shù)同學(xué)出現(xiàn)了同樣的情況，只有極少數(shù)同學(xué)的電泳結(jié)果圖上出 現(xiàn)了條帶，基本可以斷定并非由實驗操作造成?！咀⒁馐马棥?. 實驗取材為植株葉片，而不要將植株連根拔起。否則的話即便檢測出實驗材 料為插入純合突變體，由于植株已經(jīng)不存在，實驗結(jié)果就沒有了意義。2. 液氮研磨實驗材料時，注意不要將液氮倒在手上，以免將皮膚凍傷。3. 配制PCR反應(yīng)體系時由于各種試劑量較少，要靠壁滴加。4. 在用微