蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性

1、一、蛋白質(zhì)失活的機制一、蛋白質(zhì)失活的機制 根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次不同，經(jīng)常將蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次不同，經(jīng)常將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四的結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。級結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)就是共價主鏈的氨基酸序蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)就是共價主鏈的氨基酸序列，有時也稱化學結(jié)構(gòu)。二、三、四級結(jié)構(gòu)又稱列，有時也稱化學結(jié)構(gòu)。二、三、四級結(jié)構(gòu)又稱空間結(jié)構(gòu)（即三維結(jié)構(gòu)）或高級結(jié)構(gòu)?？臻g結(jié)構(gòu)（即三維結(jié)構(gòu)）或高級結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的生物功能蛋白質(zhì)的生物功能決定于它的高級結(jié)構(gòu)，高決定于它的高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)是由一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列決定的。級結(jié)構(gòu)是由一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列決定的

2、。而氨而氨基酸序列是由遺傳物質(zhì)基酸序列是由遺傳物質(zhì)DNADNA的核苷酸序列決定的。的核苷酸序列決定的。肽鍵（肽鍵（CO-NHCO-NH）是連接多肽鏈主鏈中氨基酸殘基是連接多肽鏈主鏈中氨基酸殘基的共價鍵，的共價鍵，二硫鍵（二硫鍵（-S-S-S-S-）是使多肽鏈之間交是使多肽鏈之間交聯(lián)或使多肽鏈內(nèi)成環(huán)的共價鍵。聯(lián)或使多肽鏈內(nèi)成環(huán)的共價鍵。 一、蛋白質(zhì)失活的機制一、蛋白質(zhì)失活的機制p蛋白質(zhì)不穩(wěn)定（失活）的表現(xiàn)分為兩種，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定（失活）的表現(xiàn)分為兩種，即化學即化學不穩(wěn)定和物理不穩(wěn)定。不穩(wěn)定和物理不穩(wěn)定。p化學不穩(wěn)定化學不穩(wěn)定是指蛋白質(zhì)分子通過共價鍵的形成和是指蛋白質(zhì)分子通過共價鍵的形成和斷裂形成新

3、的化學實體；斷裂形成新的化學實體；p物理不穩(wěn)定物理不穩(wěn)定指蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)的物理轉(zhuǎn)變，指蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)的物理轉(zhuǎn)變，無共價鍵改變。無共價鍵改變。物理不穩(wěn)定包括變性、聚集、沉物理不穩(wěn)定包括變性、聚集、沉淀和表面吸附。淀和表面吸附。p蛋白質(zhì)一旦發(fā)生了化學不穩(wěn)定，就會完全喪失其蛋白質(zhì)一旦發(fā)生了化學不穩(wěn)定，就會完全喪失其原有生理活性，產(chǎn)生新的功能活性或完全喪失生原有生理活性，產(chǎn)生新的功能活性或完全喪失生物活性。但物活性。但物理不穩(wěn)定現(xiàn)象一般可以通過特定的物理不穩(wěn)定現(xiàn)象一般可以通過特定的途徑恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)，而恢復(fù)原有的活性，途徑恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)，而恢復(fù)原有的活性，我們我們稱這一過程為蛋白質(zhì)的復(fù)性。

4、稱這一過程為蛋白質(zhì)的復(fù)性。 二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素 p蛋白質(zhì)的天然折疊結(jié)構(gòu)決定于蛋白質(zhì)的天然折疊結(jié)構(gòu)決定于3 3個因素：個因素： 1 1、與溶劑分子（一般為水）的相互作用；、與溶劑分子（一般為水）的相互作用； 2 2、溶劑的、溶劑的pHpH和離子組成；和離子組成； 3 3、蛋白質(zhì)的氨基酸序列。、蛋白質(zhì)的氨基酸序列。 前兩個因素的影響明確、易理解，而氨基酸前兩個因素的影響明確、易理解，而氨基酸序列的作用則不那么直覺。實際上序列的作用則不那么直覺。實際上, ,一級結(jié)構(gòu)便于一級結(jié)構(gòu)便于序列上相鄰部分之間短程相互作用的形成，也便序列上相鄰部分之間短程相

5、互作用的形成，也便于相隔部分之間長程相互作用的出現(xiàn)，于相隔部分之間長程相互作用的出現(xiàn)，雖然蛋白雖然蛋白質(zhì)分子的整個結(jié)構(gòu)出看起來像是無組織的隨機排質(zhì)分子的整個結(jié)構(gòu)出看起來像是無組織的隨機排列，然而其結(jié)構(gòu)中無例外地列，然而其結(jié)構(gòu)中無例外地有多種力處于精細的有多種力處于精細的平衡之中平衡之中，正是它決定了蛋白質(zhì)的獨特構(gòu)象。，正是它決定了蛋白質(zhì)的獨特構(gòu)象。 二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素p穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力主要是一穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力主要是一些所謂的些所謂的弱的相互作用弱的相互作用或稱或稱非共價鍵非共價鍵或或次級鍵次級鍵，包括：，包括：氫鍵、范德

6、華力、疏水氫鍵、范德華力、疏水作用和鹽鍵（離子鍵）。作用和鹽鍵（離子鍵）。此外，此外，共價二共價二硫鍵硫鍵在穩(wěn)定某些蛋白質(zhì)的構(gòu)象方面也起在穩(wěn)定某些蛋白質(zhì)的構(gòu)象方面也起著重要作用。著重要作用。p這幾種作用力的鍵能（斷裂該鍵所需的這幾種作用力的鍵能（斷裂該鍵所需的能量）都是較低的。能量）都是較低的。 二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素p氫鍵氫鍵 13-30KJ/mol13-30KJ/mol-1-1p范德華力范德華力 4-8 KJ/mol4-8 KJ/mol-1-1 p疏水作用疏水作用 12-20 KJ/mol12-20 KJ/mol-1-1 （注意：疏水作用的

7、（注意：疏水作用的數(shù)值表示在數(shù)值表示在2525非極性側(cè)鏈能夠從蛋白質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)非極性側(cè)鏈能夠從蛋白質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)移到水介質(zhì)中所需的自由能，它與其他鍵的鍵能移到水介質(zhì)中所需的自由能，它與其他鍵的鍵能不同，此數(shù)值在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加。不同，此數(shù)值在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加。實際上它并不是鍵能，此能量的大部分并不用于實際上它并不是鍵能，此能量的大部分并不用于伸展過程中鍵的斷裂。）伸展過程中鍵的斷裂。）p鹽鍵鹽鍵 12-30 KJ/mol-112-30 KJ/mol-1p二硫鍵二硫鍵 210 KJ/mol-1210 KJ/mol-1二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重

8、要因素p（一）氫鍵：（一）氫鍵： 氫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中起著極其重要的氫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中起著極其重要的作用，作用，多肽主鏈上的羰基和酰胺基之間多肽主鏈上的羰基和酰胺基之間形成的氫形成的氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力，另外，鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力，另外，氫鍵還可以在氫鍵還可以在側(cè)鏈與側(cè)鏈側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈主鏈肽基與側(cè)鏈肽基與側(cè)鏈或或主鏈肽基與水主鏈肽基與水之間形成。之間形成。 大多數(shù)蛋白質(zhì)分子所采取的折疊策略是使主大多數(shù)蛋白質(zhì)分子所采取的折疊策略是使主鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵（如鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵（如螺螺旋、旋、折疊），

9、與此同時保持大多數(shù)能成氫鍵的折疊），與此同時保持大多數(shù)能成氫鍵的側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子的表面將與水結(jié)合。側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子的表面將與水結(jié)合。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素p（二）范德華力（范德華相互作用）：（二）范德華力（范德華相互作用）：p廣義的范德華力包括廣義的范德華力包括3 3種較弱的作用力，即：種較弱的作用力，即： 定向效應(yīng)：定向效應(yīng)：發(fā)生在極性分子或極性基團之間，它是永發(fā)生在極性分子或極性基團之間，它是永久偶極間的靜電相互作用，氫鍵可被認為屬于這種范久偶極間的靜電相互作用，氫鍵可被認為屬于這種范德華力；德華力； 誘導效應(yīng)：誘導效應(yīng)：發(fā)生在極性物質(zhì)

10、與非極性物質(zhì)之間，這是發(fā)生在極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)之間，這是永久性偶極與由它誘導而來的誘導偶極之間的靜電相永久性偶極與由它誘導而來的誘導偶極之間的靜電相互作用；互作用； 分散效應(yīng)：分散效應(yīng)：是在多數(shù)情況下起主要作用的范德華力，是在多數(shù)情況下起主要作用的范德華力，它是非極性分子或基團間僅有的一種范德華力，即狹它是非極性分子或基團間僅有的一種范德華力，即狹義的范德華力，通常所說的范德華力指的就是這種作義的范德華力，通常所說的范德華力指的就是這種作用力。它是瞬時偶極間的相互作用，偶極方向是瞬時用力。它是瞬時偶極間的相互作用，偶極方向是瞬時變化的。變化的。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)

11、構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素 瞬時偶極是由于所在分子或基團中電子電荷密度瞬時偶極是由于所在分子或基團中電子電荷密度的波動，即電子運動的不對稱性造成的。瞬時偶極可的波動，即電子運動的不對稱性造成的。瞬時偶極可以誘導周圍的分子或基團產(chǎn)生誘導偶極，誘導偶極反以誘導周圍的分子或基團產(chǎn)生誘導偶極，誘導偶極反過來又穩(wěn)定了原來的偶極，因此它們之間產(chǎn)生了相互過來又穩(wěn)定了原來的偶極，因此它們之間產(chǎn)生了相互作用。作用。 狹義的范德華力是一種很弱的作用力，而且隨狹義的范德華力是一種很弱的作用力，而且隨非共價鍵合原子與分子間距離（非共價鍵合原子與分子間距離（R R）的）的6 6次方的倒數(shù)而次方的倒數(shù)而變化。變化。雖然就個

12、別來說，范德華力是很弱的，但是范雖然就個別來說，范德華力是很弱的，但是范德華相互作用數(shù)量大，并且具有加和效應(yīng)和位相效應(yīng)德華相互作用數(shù)量大，并且具有加和效應(yīng)和位相效應(yīng)（當分子或集團相同時，其瞬間偶極矩同位相，從而（當分子或集團相同時，其瞬間偶極矩同位相，從而產(chǎn)生最大的相互作用），因此，就成為一種不可忽視產(chǎn)生最大的相互作用），因此，就成為一種不可忽視的作用力。的作用力。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素（三）疏水作用：（三）疏水作用：p 水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是趨向于把疏水殘基埋藏在水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是趨向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象稱為

13、疏水作用或疏水效應(yīng)。它在穩(wěn)分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象稱為疏水作用或疏水效應(yīng)。它在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)方面占有突出地位。定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)方面占有突出地位。疏水作用其實并疏水作用其實并不是疏水基團之間有什么吸引力的緣故，而是疏水基團或不是疏水基團之間有什么吸引力的緣故，而是疏水基團或疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。當然，當疏水基當然，當疏水基團接近到等于范德華距離時，相互間將有弱的范德華引力，團接近到等于范德華距離時，相互間將有弱的范德華引力，但這不是主要的。蛋白質(zhì)溶液中的熵增加是疏水作用的主但這不是主要的。蛋白質(zhì)溶液中的熵增加是疏水作用的主要動力。要動力。p

14、疏水作用在生理溫度范圍內(nèi)隨溫度升高而加強，疏水作用在生理溫度范圍內(nèi)隨溫度升高而加強，但超過一但超過一定溫度后（定溫度后（50-6050-60，因側(cè)鏈而異），又趨減弱，因為超，因側(cè)鏈而異），又趨減弱，因為超過這個溫度，疏水基團周圍的水分子有序度降低，因而有過這個溫度，疏水基團周圍的水分子有序度降低，因而有利于疏水基團進入水中。利于疏水基團進入水中。p 非極性溶劑、去污劑是破壞疏水作用的試劑，因此是非極性溶劑、去污劑是破壞疏水作用的試劑，因此是變性變性劑劑。尿素和鹽酸胍既能破壞氫鍵，又能破壞疏水作用，因。尿素和鹽酸胍既能破壞氫鍵，又能破壞疏水作用，因此是此是強變性劑強變性劑。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)

15、定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素p （四）鹽鍵：（四）鹽鍵： 又稱鹽橋或離子鍵。它是正電荷與負電荷之間的一種靜電又稱鹽橋或離子鍵。它是正電荷與負電荷之間的一種靜電相互作用。在生理相互作用。在生理pHpH下下, ,蛋白質(zhì)中的酸性氨基酸（天冬氨酸蛋白質(zhì)中的酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）的側(cè)鏈可離解成負離子，堿性氨基酸（賴氨酸、和谷氨酸）的側(cè)鏈可離解成負離子，堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸）的側(cè)鏈可離解成正離子。精氨酸和組氨酸）的側(cè)鏈可離解成正離子。在多數(shù)情況下在多數(shù)情況下這些基團都分布在球狀蛋白質(zhì)分子表面，而與介質(zhì)水分子這些基團都分布在球狀蛋白質(zhì)分子表面，而與介質(zhì)水分子發(fā)生電

16、荷發(fā)生電荷- -偶極之間的相互作用，偶極之間的相互作用，形成排列有序的形成排列有序的水化層水化層，這對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象有著一定作用。這對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象有著一定作用。p 帶電荷的側(cè)鏈也在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部出現(xiàn)，它們一般與其他帶電荷的側(cè)鏈也在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部出現(xiàn)，它們一般與其他基團形成強的氫鍵，但是偶爾也有少數(shù)帶相反電荷的側(cè)鏈基團形成強的氫鍵，但是偶爾也有少數(shù)帶相反電荷的側(cè)鏈在分子的疏水作用內(nèi)部形成鹽鍵。在分子的疏水作用內(nèi)部形成鹽鍵。在疏水環(huán)境中，介電常在疏水環(huán)境中，介電常數(shù)比在水中低，相反電荷間的吸引力相應(yīng)增大。當荷電側(cè)數(shù)比在水中低，相反電荷間的吸引力相應(yīng)增大。當荷電側(cè)鏈從水中轉(zhuǎn)移到分子內(nèi)部時，它周

17、圍有序排列的水分子被鏈從水中轉(zhuǎn)移到分子內(nèi)部時，它周圍有序排列的水分子被釋放到介質(zhì)水中，因此，鹽鍵的形成不僅是靜電吸引而且釋放到介質(zhì)水中，因此，鹽鍵的形成不僅是靜電吸引而且也是熵增加的過程。也是熵增加的過程。升高溫度，可以增加鹽橋的穩(wěn)定性。升高溫度，可以增加鹽橋的穩(wěn)定性。此外，鹽鍵因加入非極性溶劑而加強，加入鹽類而減弱。此外，鹽鍵因加入非極性溶劑而加強，加入鹽類而減弱。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素p（五）二硫鍵：（五）二硫鍵： 二硫鍵的形成并不規(guī)定多肽鏈的折疊。二硫鍵的形成并不規(guī)定多肽鏈的折疊。然而一旦蛋白質(zhì)采取了它的三維結(jié)構(gòu)，然而一旦蛋白質(zhì)采取了它的

18、三維結(jié)構(gòu)，則二硫鍵的形成將對此構(gòu)象起穩(wěn)定作用。則二硫鍵的形成將對此構(gòu)象起穩(wěn)定作用。同一個蛋白質(zhì)中，有些二硫鍵是生物活同一個蛋白質(zhì)中，有些二硫鍵是生物活性所必需的，另一些二硫鍵則不是生物性所必需的，另一些二硫鍵則不是生物活性所必需的，但與維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定活性所必需的，但與維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有關(guān)，有關(guān)，假如蛋白質(zhì)中所有的二硫鍵相繼假如蛋白質(zhì)中所有的二硫鍵相繼被還原，將引起蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象改變被還原，將引起蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象改變和生物活性丟失。和生物活性丟失。 三、環(huán)境因素對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響三、環(huán)境因素對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響p物理因素物理因素：溫度、紫外線照射、高壓和表面張：溫度、紫外線照射、高壓和表面

19、張力等；力等；p化學因素化學因素：有機溶劑、脲、胍、酸、堿等；如：有機溶劑、脲、胍、酸、堿等；如尿素和鹽酸胍，一方面能與多肽主鏈競爭氫鍵，尿素和鹽酸胍，一方面能與多肽主鏈競爭氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；更重要的是它們可以破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；更重要的是它們可以增加非極性側(cè)鏈在水中的溶解度，因而降低了增加非極性側(cè)鏈在水中的溶解度，因而降低了維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的疏水相互作用。維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的疏水相互作用。p酶的作用酶的作用：一些蛋白質(zhì)分解酶類的作用。：一些蛋白質(zhì)分解酶類的作用。p微生物因素微生物因素：微生物分解利用蛋白質(zhì)進行生長：微生物分解利用蛋白質(zhì)進行生長繁殖繁殖 三、環(huán)境因素對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性

20、的影響三、環(huán)境因素對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響p值得注意的是：值得注意的是：蛋白質(zhì)的變性是一個蛋白質(zhì)的變性是一個協(xié)協(xié)同過程，同過程，它是在所加變性劑的很窄濃度它是在所加變性劑的很窄濃度范圍內(nèi)或很窄范圍內(nèi)或很窄pHpH或溫度間隔內(nèi)突然發(fā)生或溫度間隔內(nèi)突然發(fā)生的。的。四、分離純化中保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法四、分離純化中保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法 1 1、盡量在相對密封和無菌的環(huán)境下、盡量在相對密封和無菌的環(huán)境下快速快速進行進行分離純化操作；分離純化操作； 2 2、在生理溫度和壓力范圍內(nèi)完成分離純化操、在生理溫度和壓力范圍內(nèi)完成分離純化操作；作； 3 3、慎用溶劑和酸、堿、鹽類，使用前要進行、慎用溶劑和酸、堿、鹽類，

21、使用前要進行詳細的試驗，詳細的試驗，確定最佳添加量和條件確定最佳添加量和條件； 4 4、鈍化或抑制蛋白質(zhì)分解酶類的活性；、鈍化或抑制蛋白質(zhì)分解酶類的活性； 5 5、選擇合適分離方法。如：凝膠過濾、離子、選擇合適分離方法。如：凝膠過濾、離子交換、吸附層析、親和層析、電泳、結(jié)晶等。交換、吸附層析、親和層析、電泳、結(jié)晶等。 五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì) p重組蛋白質(zhì)的過量表達常常導致其在胞內(nèi)發(fā)生錯重組蛋白質(zhì)的過量表達常常導致其在胞內(nèi)發(fā)生錯誤折疊和聚集，誤折疊和聚集，形成被稱為包含體的集聚體。形成被稱為包含體的集聚體。 p包含體主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是基因包含體主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)

22、成，其中大部分是基因表達產(chǎn)物。這些基因表達產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確表達產(chǎn)物。這些基因表達產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生理活性立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生理活性。p對于以包含體形式表達的蛋白質(zhì)，需要在分離回對于以包含體形式表達的蛋白質(zhì)，需要在分離回收包含體后，溶解包含體使其肽鏈伸展，然后在收包含體后，溶解包含體使其肽鏈伸展，然后在合適的溶液環(huán)境下使目標蛋白質(zhì)恢復(fù)天然構(gòu)型和合適的溶液環(huán)境下使目標蛋白質(zhì)恢復(fù)天然構(gòu)型和生物活性，這一過程稱為生物活性，這一過程稱為蛋白質(zhì)的體外再折疊或蛋白質(zhì)的體外再折疊或復(fù)性復(fù)性。五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì)( (一一) )包含體

23、的形成包含體的形成 目前，關(guān)于包含體的形成機理尚不完全目前，關(guān)于包含體的形成機理尚不完全清楚，一般認為包含體的形成是清楚，一般認為包含體的形成是部分折疊的部分折疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用的結(jié)果。中間態(tài)之間疏水性相互作用的結(jié)果。 主要原因是蛋白質(zhì)本身具有易于聚集沉主要原因是蛋白質(zhì)本身具有易于聚集沉淀的性質(zhì)，或表達產(chǎn)物周圍的物理環(huán)境（如淀的性質(zhì)，或表達產(chǎn)物周圍的物理環(huán)境（如溫度、離子組成）不適或某些折疊輔助因子溫度、離子組成）不適或某些折疊輔助因子（分子伴侶）的作用。（分子伴侶）的作用。 五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì)p現(xiàn)代研究表明：在大多數(shù)情況下，現(xiàn)代研究表明：在大多數(shù)情況下，包

24、含包含體的形成是體的形成是蛋白質(zhì)過量表達蛋白質(zhì)過量表達的結(jié)果，而的結(jié)果，而與蛋白質(zhì)的種類和表達系統(tǒng)無關(guān)，與蛋白質(zhì)的種類和表達系統(tǒng)無關(guān)，即包即包含體的形成與其相對分子質(zhì)量、疏水性含體的形成與其相對分子質(zhì)量、疏水性以及折疊途徑等內(nèi)在性質(zhì)沒有必然的聯(lián)以及折疊途徑等內(nèi)在性質(zhì)沒有必然的聯(lián)系。換句話說，對于任何蛋白質(zhì)和任何系。換句話說，對于任何蛋白質(zhì)和任何表達系統(tǒng)，在過量表達的情況下都可能表達系統(tǒng)，在過量表達的情況下都可能形成包含體。形成包含體。p蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和包含體的形成為蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和包含體的形成為動動力學競爭力學競爭的結(jié)果。的結(jié)果。 五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì) U ki I

25、 kr N U ki I kr N ka ka A A其中：其中：U U為伸展肽鏈；為伸展肽鏈；I I為折疊過程的中間態(tài)；為折疊過程的中間態(tài)；N N為天為天然活性態(tài)；然活性態(tài)；A A為聚集體（包含體），為聚集體（包含體），kiki、krkr、kaka分分別為中間體生成速率常數(shù)、折疊速率常數(shù)和聚集體別為中間體生成速率常數(shù)、折疊速率常數(shù)和聚集體生成速率常數(shù)。生成速率常數(shù)。 活性產(chǎn)物活性產(chǎn)物N N的形成為分子內(nèi)折疊反應(yīng)，折疊速的形成為分子內(nèi)折疊反應(yīng)，折疊速率與濃度成正比；聚集體率與濃度成正比；聚集體A A的形成反應(yīng)在分子間發(fā)的形成反應(yīng)在分子間發(fā)生，生，反應(yīng)速率與濃度的高次方成正比，即反應(yīng)級數(shù)反應(yīng)速率

26、與濃度的高次方成正比，即反應(yīng)級數(shù)22。因此，如果新生肽濃度增加和中間態(tài)的疏水因此，如果新生肽濃度增加和中間態(tài)的疏水相互作用就可能導致包含體的形成。相互作用就可能導致包含體的形成。五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì)p上述分析表明，包含體的形成是不可預(yù)測上述分析表明，包含體的形成是不可預(yù)測的，取決于的，取決于系統(tǒng)的表達速度和濃度系統(tǒng)的表達速度和濃度。但當。但當含有二硫鍵的蛋白質(zhì)在細菌的胞液中表達含有二硫鍵的蛋白質(zhì)在細菌的胞液中表達時，時，由于胞液為還原性，巰基間不能被氧由于胞液為還原性，巰基間不能被氧化形成二硫鍵而導致錯誤折疊，化形成二硫鍵而導致錯誤折疊，必然會形必然會形成包含體。成包含

27、體。五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì)p（二）包含體形成的利與弊（二）包含體形成的利與弊 胞內(nèi)重組蛋白質(zhì)包含體的沉積可能是胞內(nèi)重組蛋白質(zhì)包含體的沉積可能是“天堂天堂”，也可能是也可能是“地獄地獄”。至于是。至于是“天堂天堂”還是還是“地地獄獄”，主要取決于，主要取決于沉積的包含體蛋白質(zhì)是否容易沉積的包含體蛋白質(zhì)是否容易復(fù)性復(fù)性。p1 1、包含體的體內(nèi)抑制、包含體的體內(nèi)抑制p對于那些難于復(fù)性的蛋白質(zhì)（如相對分子量較大、對于那些難于復(fù)性的蛋白質(zhì)（如相對分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜和含有較多二硫鍵的蛋白質(zhì)），包含體結(jié)構(gòu)復(fù)雜和含有較多二硫鍵的蛋白質(zhì)），包含體的形成意味著表達系統(tǒng)的失敗，的形成意味著表

28、達系統(tǒng)的失敗，必須著力于胞內(nèi)必須著力于胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)表達的研究，避免包含體的形成，可溶性蛋白質(zhì)表達的研究，避免包含體的形成，提高可溶性蛋白質(zhì)的表達量，即包含體的體內(nèi)抑提高可溶性蛋白質(zhì)的表達量，即包含體的體內(nèi)抑制，制，主要方法有：主要方法有：五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì) （1 1）降低細胞培養(yǎng)溫度，減緩蛋白質(zhì)的表達）降低細胞培養(yǎng)溫度，減緩蛋白質(zhì)的表達速度和降低表達量；速度和降低表達量； （2 2）將目標蛋白質(zhì)與分子伴侶蛋白、折疊酶）將目標蛋白質(zhì)與分子伴侶蛋白、折疊酶和二硫鍵異構(gòu)酶共表達，彌補外源蛋白質(zhì)表達過和二硫鍵異構(gòu)酶共表達，彌補外源蛋白質(zhì)表達過程中缺乏的輔助因子；程中缺乏的

29、輔助因子； （3 3）使用非代謝性碳源，降低代謝速度和蛋）使用非代謝性碳源，降低代謝速度和蛋白質(zhì)表達量；白質(zhì)表達量； (4)(4)將目標蛋白質(zhì)與親水性蛋白質(zhì)融合表達，將目標蛋白質(zhì)與親水性蛋白質(zhì)融合表達，常用的融合蛋白質(zhì)有常用的融合蛋白質(zhì)有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白和硫氧還原蛋白。合蛋白和硫氧還原蛋白。五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì) 2 2以包含體形式表達重組蛋白質(zhì)的優(yōu)勢以包含體形式表達重組蛋白質(zhì)的優(yōu)勢 （1 1）包含體蛋白質(zhì)主要在以大腸桿菌為宿）包含體蛋白質(zhì)主要在以大腸桿菌為宿主細胞的原核細胞表達系統(tǒng)中形成，而大腸主細胞的原核細胞表達系統(tǒng)中形成，而大腸

30、桿菌生長速度快，易于高密度培養(yǎng)，有利于桿菌生長速度快，易于高密度培養(yǎng)，有利于大規(guī)模生產(chǎn)目標蛋白質(zhì)；大規(guī)模生產(chǎn)目標蛋白質(zhì)； （2 2）包含體是在過量表達的情況下形成的，）包含體是在過量表達的情況下形成的，因此一般包含體蛋白質(zhì)的表達量都很高；因此一般包含體蛋白質(zhì)的表達量都很高； （3 3）包含體富含目的基因表達產(chǎn)物，有利）包含體富含目的基因表達產(chǎn)物，有利于后續(xù)的分離純化。在適宜的包含體提取和于后續(xù)的分離純化。在適宜的包含體提取和純化條件下，目標產(chǎn)物純度可達純化條件下，目標產(chǎn)物純度可達90%90%以上；以上； 以包含體形式表達重組蛋白質(zhì)的優(yōu)勢以包含體形式表達重組蛋白質(zhì)的優(yōu)勢 （4 4）沉積于包含體內(nèi)

31、的目標蛋白質(zhì)不）沉積于包含體內(nèi)的目標蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解；易被蛋白酶水解； （5 5）對于那些對宿主細胞有毒害作用）對于那些對宿主細胞有毒害作用或殺傷作用的目的基因表達產(chǎn)物，以包或殺傷作用的目的基因表達產(chǎn)物，以包含體形式表達是最可取的生產(chǎn)途徑。含體形式表達是最可取的生產(chǎn)途徑。五、包含體的形成與性質(zhì)五、包含體的形成與性質(zhì)（二）包含體的性質(zhì)（二）包含體的性質(zhì) 1 1、包含體為高密度蛋白質(zhì)聚集體，、包含體為高密度蛋白質(zhì)聚集體，密度密度約約1.3g/ml.1.3g/ml.顆粒尺寸約顆粒尺寸約0.1-1.0 m0.1-1.0 m , ,有些有些達達3m3m，對表達產(chǎn)物和表達系統(tǒng)而異。，對表達產(chǎn)物和表達

32、系統(tǒng)而異。 2 2、包含體通常位于細胞質(zhì)中，而一些分、包含體通常位于細胞質(zhì)中，而一些分泌性蛋白質(zhì)可能在外周胞質(zhì)中形成。泌性蛋白質(zhì)可能在外周胞質(zhì)中形成。 3 3、包含體的主要成分為基因表達產(chǎn)物，、包含體的主要成分為基因表達產(chǎn)物，占包含體的占包含體的50%50%以上，其他成分因表達系統(tǒng)以上，其他成分因表達系統(tǒng)而異，包括磷脂、微量的質(zhì)粒、而異，包括磷脂、微量的質(zhì)粒、rRNArRNA和和RNARNA聚合酶，更多的是黏附于包含體顆粒的外聚合酶，更多的是黏附于包含體顆粒的外膜蛋白質(zhì)。膜蛋白質(zhì)。六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解 p1 1、包含體的分離、包含體的分離 包含體分離的最常用的方

33、法就是：機械包含體分離的最常用的方法就是：機械破碎后進行離心沉降和膜分離（洗濾）。破碎后進行離心沉降和膜分離（洗濾）。 包含體為致密的蛋白質(zhì)聚集體，密度較包含體為致密的蛋白質(zhì)聚集體，密度較大，達大，達1.3g/ml1.3g/ml，高強度的機械破碎后，低，高強度的機械破碎后，低速離心便可沉淀，從而使之與細胞碎片和速離心便可沉淀，從而使之與細胞碎片和可溶性產(chǎn)物分離。可溶性產(chǎn)物分離。 六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p2 2、包含體的純化、包含體的純化p原因原因：蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和包含體的形成為：蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和包含體的形成為動動力學競爭力學競爭的結(jié)果。也就是說，蛋白質(zhì)的復(fù)性是

34、的結(jié)果。也就是說，蛋白質(zhì)的復(fù)性是分子內(nèi)折疊和分子間聚集反應(yīng)的競爭動力學過分子內(nèi)折疊和分子間聚集反應(yīng)的競爭動力學過程。因此，程。因此，為了提高蛋白質(zhì)的復(fù)性收率，必須為了提高蛋白質(zhì)的復(fù)性收率，必須抑制聚集體的生成，促進復(fù)性反應(yīng)向正確折疊抑制聚集體的生成，促進復(fù)性反應(yīng)向正確折疊的方向進行。的方向進行。研究表明：在質(zhì)粒研究表明：在質(zhì)粒DNADNA、脂多糖、脂多糖和其他蛋白質(zhì)存在時，蛋白質(zhì)的聚集體生成速和其他蛋白質(zhì)存在時，蛋白質(zhì)的聚集體生成速率增大，復(fù)性收率降低，而純化的變性率增大，復(fù)性收率降低，而純化的變性/ /還原還原蛋白質(zhì)的復(fù)性收率可以得到大幅度的提高。因蛋白質(zhì)的復(fù)性收率可以得到大幅度的提高。因此

35、，此，包含體的純度對復(fù)性收率影響顯著，為了包含體的純度對復(fù)性收率影響顯著，為了實現(xiàn)較高的蛋白質(zhì)復(fù)性收率，必須進行包含體實現(xiàn)較高的蛋白質(zhì)復(fù)性收率，必須進行包含體的純化。的純化。 六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p方法：方法：包含體的純化過程因表達系統(tǒng)和包含體的純化過程因表達系統(tǒng)和表達產(chǎn)物而異，表達產(chǎn)物而異，沒有通用的最佳方案。沒有通用的最佳方案。因此，對于特定的表達系統(tǒng)和表達產(chǎn)物，因此，對于特定的表達系統(tǒng)和表達產(chǎn)物，需要根據(jù)具體情況進行過程開發(fā)試驗，需要根據(jù)具體情況進行過程開發(fā)試驗，確定適宜的純化方案。確定適宜的純化方案。經(jīng)常采用的包含經(jīng)常采用的包含體分離純化過程包括差速離心

36、和反復(fù)洗體分離純化過程包括差速離心和反復(fù)洗滌步驟，以最大限度地清除難以去除的滌步驟，以最大限度地清除難以去除的膜蛋白質(zhì)膜蛋白質(zhì)。p可參考的一般過程如下：可參考的一般過程如下： 六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p路線路線1 1：p細胞破碎。細胞破碎。為提高下一步的離心分離效率，為提高下一步的離心分離效率，需進行高強度的破碎（利用高壓勻漿破碎時需需進行高強度的破碎（利用高壓勻漿破碎時需反復(fù)操作多次）。反復(fù)操作多次）。p離心沉降回收包含體。離心沉降回收包含體。在較高的離心機轉(zhuǎn)數(shù)在較高的離心機轉(zhuǎn)數(shù)（離心力）下除去可溶性組分和沉降速度較?。x心力）下除去可溶性組分和沉降速度較小的細胞

37、碎片，回收沉降的粗包含體。的細胞碎片，回收沉降的粗包含體。p粗包含體的洗滌。粗包含體的洗滌。向粗包含體中加入鰲合劑向粗包含體中加入鰲合劑EDTA(EDTA(乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸) )和低濃度變性劑（如和低濃度變性劑（如1- 1- 4mol/L4mol/L尿素，或尿素，或1 1一一2mol/L2mol/L鹽酸胍）或表面活鹽酸胍）或表面活性劑（如性劑（如1-20g/L Triton X-1001-20g/L Triton X-100聚氧乙烯烷基聚氧乙烯烷基酚酚) ,) ,溶解吸附在包含體表面的磷脂和膜蛋白溶解吸附在包含體表面的磷脂和膜蛋白質(zhì)。同時加入一定濃度的蔗糖，提高包含體懸質(zhì)。同時加入一定

38、濃度的蔗糖，提高包含體懸浮液的密度。浮液的密度。六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p離心沉降回收包含體。離心沉降回收包含體。在較低的轉(zhuǎn)數(shù)在較低的轉(zhuǎn)數(shù)下離心分離，回收沉降的包含體。下離心分離，回收沉降的包含體。p根據(jù)需要，可重復(fù)上述步驟根據(jù)需要，可重復(fù)上述步驟和和，直至達到滿意的包含體純度。直至達到滿意的包含體純度。六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p細胞破碎可采用機械破碎和酶解相結(jié)合的方細胞破碎可采用機械破碎和酶解相結(jié)合的方法，以提高破碎效率。包含體純化過程中也法，以提高破碎效率。包含體純化過程中也可利用核酸水解酶，提高核酸去除率。可利用核酸水解酶，提高核酸

39、去除率。De De Bernardez ClarkBernardez Clark等提出的利用酶解輔助細等提出的利用酶解輔助細胞破碎和包含體純化的過程如下胞破碎和包含體純化的過程如下（路線（路線II )II )： p離心分離，回收細胞。離心分離，回收細胞。p向回收的細胞中加入含向回收的細胞中加入含lmmol/L EDTAlmmol/L EDTA和和1. 1. 5mg/mL5mg/mL溶菌酶的溶菌酶的TrisTris緩沖溶液（三羥甲基氨緩沖溶液（三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液）基甲烷緩沖溶液）(0.lmol/L, pH=7.0)(0.lmol/L, pH=7.0)，細，細胞濃度為胞濃度為20g/L20g

40、/L（濕重），總體積為（濕重），總體積為V V。放置。放置30min30min。 六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p細胞破碎細胞破碎：反復(fù)機械破碎，使細胞破碎完全。：反復(fù)機械破碎，使細胞破碎完全。p核酸水解：核酸水解：向細胞破碎液中加入向細胞破碎液中加入DNADNA水解酶水解酶(DNase(DNase）至）至10g/mL10g/mL和和MgCl2MgCl2至至3mmol/L3mmol/L。2525溫浴溫浴30min30min，水解，水解DNADNA。p包含體洗滌：包含體洗滌：向上述懸浮液中加人向上述懸浮液中加人Triton X-100Triton X-100至至20g/L,

41、 NaCl20g/L, NaCl至至1.5mo1/L, EDTA1.5mo1/L, EDTA至至20mmo1/L,20mmo1/L,懸浮懸浮液體積為液體積為3V3V。 44攪拌攪拌30min30min。p離心分離回收包含體。離心分離回收包含體。p包含體洗滌：包含體洗滌：向回收的包含體中加入向回收的包含體中加入TrisTris至至0.lmol/L (pH=7.0),EDTA0.lmol/L (pH=7.0),EDTA至至20mmol/L,20mmol/L,懸浮液體積懸浮液體積為為8V8V。p 離心分離回收純化的包含體。離心分離回收純化的包含體。六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解

42、p3 3、包含體的溶解、包含體的溶解 目的：目的：獲得適當純度的包含體后，需要獲得適當純度的包含體后，需要對包含體進行溶解，對包含體進行溶解，使目標蛋白質(zhì)的肽使目標蛋白質(zhì)的肽鏈伸展，為進一步的復(fù)性創(chuàng)造條件。鏈伸展，為進一步的復(fù)性創(chuàng)造條件。 方法：方法：包含體溶解的方法：包含體溶解的方法： 1 1、加入高濃度的強變性劑：如、加入高濃度的強變性劑：如6-6-8mol/L8mol/L的鹽酸胍或的鹽酸胍或8mol/L8mol/L的尿素。的尿素。 2 2、加入硫氰酸鹽或表面活性劑。、加入硫氰酸鹽或表面活性劑。 3 3、對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需、對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯配的二硫鍵。

43、加入還原劑解離錯配的二硫鍵。 六、包含體的分離純化與溶解六、包含體的分離純化與溶解p常用的還原劑有常用的還原劑有1-100mmol/L1-100mmol/L的二硫蘇糖醇（的二硫蘇糖醇（DTTDTT），），1-200mmol/L1-200mmol/L的的-巰基乙醇和半胱氨酸等，有時還需巰基乙醇和半胱氨酸等，有時還需要加入螯合劑要加入螯合劑, ,以清除重金屬離子（如加入以清除重金屬離子（如加入2mol/L2mol/L的的EDTAEDTA等）。等）。p注意：溶解后的包含體蛋白質(zhì)中仍會存在一些諸如非注意：溶解后的包含體蛋白質(zhì)中仍會存在一些諸如非目標蛋白質(zhì)、核酸和細胞膜組分等雜質(zhì)，為了提高復(fù)目標蛋白質(zhì)、

44、核酸和細胞膜組分等雜質(zhì)，為了提高復(fù)性收率，在復(fù)性前要對變形性收率，在復(fù)性前要對變形/ /還原的蛋白質(zhì)進一步純還原的蛋白質(zhì)進一步純化。主要方法有化。主要方法有凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相色譜和固定化金屬離子色譜等。純化操作中使用的流色譜和固定化金屬離子色譜等。純化操作中使用的流動相需保證蛋白質(zhì)處于變性動相需保證蛋白質(zhì)處于變性/ /還原狀態(tài)，如苯酚、正還原狀態(tài)，如苯酚、正丁醇等。丁醇等。如果要保存變性蛋白質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)變換如果要保存變性蛋白質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)變換到酸性溶液中（到酸性溶液中（10%10%醋酸或醋酸或5-10mmol/L5-10mmol/L鹽酸），并

45、冷鹽酸），并冷凍干燥。復(fù)性前用變性劑重新溶解干粉，就可以進行凍干燥。復(fù)性前用變性劑重新溶解干粉，就可以進行蛋白質(zhì)的復(fù)性操作。蛋白質(zhì)的復(fù)性操作。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p( (一一) )蛋白質(zhì)復(fù)性的方法蛋白質(zhì)復(fù)性的方法七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p1 1、直接稀釋復(fù)性：、直接稀釋復(fù)性：即將變性蛋白質(zhì)溶液直接稀即將變性蛋白質(zhì)溶液直接稀釋到適宜的復(fù)性緩沖液中。釋到適宜的復(fù)性緩沖液中。p變性蛋白質(zhì)是溶解在高濃度變性劑中的，降低變變性蛋白質(zhì)是溶解在高濃度變性劑中的，降低變性劑濃度至非變性濃度范圍即可引發(fā)蛋白質(zhì)的折性劑濃度至非變性濃度范圍即可引發(fā)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。當變性劑濃度降低后，伸展的肽鏈疊復(fù)性

46、。當變性劑濃度降低后，伸展的肽鏈U U迅迅速折疊成具有豐富的二級結(jié)構(gòu)（速折疊成具有豐富的二級結(jié)構(gòu)（螺旋和螺旋和折疊折疊結(jié)構(gòu)）和部分三級結(jié)構(gòu)的中間體結(jié)構(gòu)）和部分三級結(jié)構(gòu)的中間體I I，該過程非常，該過程非常迅速，通常在幾毫秒內(nèi)完成，因此，迅速，通常在幾毫秒內(nèi)完成，因此，I I的生成可的生成可以認為是瞬間完成（即以認為是瞬間完成（即kiki）, ,蛋白質(zhì)的折疊蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和聚集體的形成過程可以簡化為從中間體復(fù)性和聚集體的形成過程可以簡化為從中間體I I折疊成天然活性態(tài)折疊成天然活性態(tài)N N和生成聚集體和生成聚集體A A的平行反應(yīng)。的平行反應(yīng)。 A A Ka Ka I I Kr Kr N N七、

47、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p注意：聚集體的形成是蛋白質(zhì)過量表達的注意：聚集體的形成是蛋白質(zhì)過量表達的結(jié)果。因此，在這個過程中，蛋白質(zhì)的復(fù)結(jié)果。因此，在這個過程中，蛋白質(zhì)的復(fù)性收率一般是隨變性蛋白質(zhì)溶液濃度的提性收率一般是隨變性蛋白質(zhì)溶液濃度的提高而降低的，而聚集體的生成速率隨濃度高而降低的，而聚集體的生成速率隨濃度的提高而增大。即：的提高而增大。即：UU則則I,NI,N。因此，。因此，在稀釋復(fù)性過程中，若復(fù)性系統(tǒng)的混合不在稀釋復(fù)性過程中，若復(fù)性系統(tǒng)的混合不利，會造成局部蛋白濃度過高，使復(fù)性收利，會造成局部蛋白濃度過高，使復(fù)性收率下降，在設(shè)計復(fù)性反應(yīng)器時，要盡量考率下降，在設(shè)計復(fù)性反應(yīng)器時，要盡量

48、考慮混合攪拌均勻。慮混合攪拌均勻。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性，需要添加氧對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性，需要添加氧化劑和還原劑，調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境，化劑和還原劑，調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境，促進正確二硫鍵的形成，促進正確二硫鍵的形成，常見的氧化常見的氧化/ /還原劑還原劑有：氧化型谷光甘肽（有：氧化型谷光甘肽（GSSGGSSG）/ /還原型谷光甘還原型谷光甘肽（肽（GSHGSH）, ,胱氨酸胱氨酸/ /半胱氨酸或在金屬離子半胱氨酸或在金屬離子（如（如Cu2+Cu2+）存在下的空氣中氧化。）存在下的空氣中氧化。p氧化復(fù)性通常在弱堿性（氧化復(fù)性通常在弱堿性（pH

49、=7.5-9.5pH=7.5-9.5）緩沖溶）緩沖溶液中進行，在此液中進行，在此pHpH值條件下有利于硫醇陰離子值條件下有利于硫醇陰離子的形成，促進二硫鍵的形成和交換。同時，的形成，促進二硫鍵的形成和交換。同時，氧氧化還原劑的濃度對復(fù)性收率影響顯著。具體濃化還原劑的濃度對復(fù)性收率影響顯著。具體濃度范圍要根據(jù)實驗確定。度范圍要根據(jù)實驗確定。因為，一般情況下，因為，一般情況下，不同蛋白質(zhì)的最佳復(fù)性條件不同，并且同一種不同蛋白質(zhì)的最佳復(fù)性條件不同，并且同一種蛋白質(zhì)在不同濃度下的最佳條件也不完全相同，蛋白質(zhì)在不同濃度下的最佳條件也不完全相同，這也是蛋白質(zhì)復(fù)性的特點和難點之一。這也是蛋白質(zhì)復(fù)性的特點和難

50、點之一。七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p2 2、流加復(fù)性、流加復(fù)性 p降低蛋白質(zhì)濃度有利于獲得較高的復(fù)性收率，降低蛋白質(zhì)濃度有利于獲得較高的復(fù)性收率，因因此，為了提高復(fù)性收率，通常需要在較低的濃度此，為了提高復(fù)性收率，通常需要在較低的濃度下進行蛋白質(zhì)復(fù)性操作，有時蛋白質(zhì)的濃度需低下進行蛋白質(zhì)復(fù)性操作，有時蛋白質(zhì)的濃度需低于于0.01mg/ml0.01mg/ml。但是，降低蛋白質(zhì)濃度勢必會增大。但是，降低蛋白質(zhì)濃度勢必會增大復(fù)性液的體積，給后續(xù)的分離純化增加困難。為復(fù)性液的體積，給后續(xù)的分離純化增加困難。為了實現(xiàn)高濃度下的高收率復(fù)性，產(chǎn)生了了實現(xiàn)高濃度下的高收率復(fù)性，產(chǎn)生了將變性蛋將變性蛋白質(zhì)分批

51、次加入到復(fù)性液中或采用連續(xù)流加到復(fù)白質(zhì)分批次加入到復(fù)性液中或采用連續(xù)流加到復(fù)性液中的流加復(fù)性法。性液中的流加復(fù)性法。由于在流加變性蛋白質(zhì)的由于在流加變性蛋白質(zhì)的同時，復(fù)性液中的蛋白質(zhì)發(fā)生折疊復(fù)性，使變性同時，復(fù)性液中的蛋白質(zhì)發(fā)生折疊復(fù)性，使變性蛋白質(zhì)（折疊中間體）濃度始終保持在較低的水蛋白質(zhì)（折疊中間體）濃度始終保持在較低的水平，最終可在較高的蛋白質(zhì)濃度下獲得較高的復(fù)平，最終可在較高的蛋白質(zhì)濃度下獲得較高的復(fù)性收率。性收率。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p3 3、透析（或洗濾）復(fù)性：、透析（或洗濾）復(fù)性：即采用高親水即采用高親水性膜材料進行透析或超濾的方法降低變性膜材料進行透析或超濾的方法降低

52、變性劑濃度和調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境。性劑濃度和調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境。p4 4、添加劑輔助復(fù)性：、添加劑輔助復(fù)性：由于聚集體的形成由于聚集體的形成是導致復(fù)性收率降低的主要原因，在控是導致復(fù)性收率降低的主要原因，在控制復(fù)性液的制復(fù)性液的pHpH值、溫度和氧化還原劑濃值、溫度和氧化還原劑濃度等參數(shù)同時，研究者努力嘗試在稀釋度等參數(shù)同時，研究者努力嘗試在稀釋復(fù)性中添加各種小分子溶質(zhì)，以抑制聚復(fù)性中添加各種小分子溶質(zhì)，以抑制聚集體的生成。即利用添加一些小分子溶集體的生成。即利用添加一些小分子溶質(zhì)等輔助因子的稀釋復(fù)性法，又稱為稀質(zhì)等輔助因子的稀釋復(fù)性法，又稱為稀釋添加復(fù)性。常用的稀釋添加劑見下表。釋

53、添加復(fù)性。常用的稀釋添加劑見下表。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的機理尚不完全清楚，但添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的機理尚不完全清楚，但一般認為主要有以下兩種作用：一般認為主要有以下兩種作用：穩(wěn)定天然肽蛋穩(wěn)定天然肽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；提高折疊中間體或伸展肽鏈的溶解度（穩(wěn)定性）。提高折疊中間體或伸展肽鏈的溶解度（穩(wěn)定性）。p不同添加劑的作用機理不同。不同添加劑的作用機理不同。甘油的作用甘油的作用是穩(wěn)定是穩(wěn)定天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高其熱力學穩(wěn)定性，促進天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，

54、提高其熱力學穩(wěn)定性，促進折疊反應(yīng)的進行；折疊反應(yīng)的進行；低濃度變性劑、聚乙二醇和表低濃度變性劑、聚乙二醇和表面活性劑等其他大部分添加劑的作用面活性劑等其他大部分添加劑的作用是提高折疊是提高折疊中間體或伸展膚鏈的溶解度，抑制聚集體的生成。中間體或伸展膚鏈的溶解度，抑制聚集體的生成。低濃度變性劑（如鹽酸胍）可誘導酸變性蛋白質(zhì)低濃度變性劑（如鹽酸胍）可誘導酸變性蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的生成，穩(wěn)定復(fù)性過程中的熔球態(tài)中間二級結(jié)構(gòu)的生成，穩(wěn)定復(fù)性過程中的熔球態(tài)中間體。體。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p蛋白質(zhì)折疊復(fù)性過程復(fù)雜多變，利用稀蛋白質(zhì)折疊復(fù)性過程復(fù)雜多變，利用稀釋添加劑需要注意如下問題：釋添加劑需要注意如

55、下問題： 添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的作用具有添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的作用具有選擇性，即一種添加劑可能對某種蛋白選擇性，即一種添加劑可能對某種蛋白質(zhì)復(fù)性具有輔助作用，而對其他蛋白質(zhì)質(zhì)復(fù)性具有輔助作用，而對其他蛋白質(zhì)復(fù)性無作用，甚至起反作用。例如，聚復(fù)性無作用，甚至起反作用。例如，聚乙二醇可輔助碳酸脫水酶乙二醇可輔助碳酸脫水酶(carbonic (carbonic anhydrase B)anhydrase B)復(fù)性，但對溶菌酶復(fù)性無復(fù)性，但對溶菌酶復(fù)性無影響。影響。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p對于那些穩(wěn)定折疊中間體或伸展膚鏈的添加劑，對于那些穩(wěn)定折疊中間體或伸展膚鏈的添加劑，添加劑的輔助作用在一定

56、的濃度范圍內(nèi)有效，即存添加劑的輔助作用在一定的濃度范圍內(nèi)有效，即存在最佳濃度或濃度范圍。在較低的濃度下添加劑的在最佳濃度或濃度范圍。在較低的濃度下添加劑的輔助作用不明顯，而在較高的濃度下復(fù)性收率亦降輔助作用不明顯，而在較高的濃度下復(fù)性收率亦降低。這是由于這類添加劑在抑制聚集體生成的同時，低。這是由于這類添加劑在抑制聚集體生成的同時，也會抑制蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，造成折疊速率和聚集也會抑制蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，造成折疊速率和聚集體生成速率均隨濃度提高而下降。體生成速率均隨濃度提高而下降。p添加劑的最佳濃度或濃度范圍與蛋白質(zhì)種類和濃添加劑的最佳濃度或濃度范圍與蛋白質(zhì)種類和濃度有關(guān)。即不同蛋白質(zhì)復(fù)性所需的添

57、加劑濃度不同，度有關(guān)。即不同蛋白質(zhì)復(fù)性所需的添加劑濃度不同，并且隨蛋白質(zhì)濃度的提高，所需添加劑濃度也會提并且隨蛋白質(zhì)濃度的提高，所需添加劑濃度也會提高。因此，一般添加劑的輔助作用在較低的蛋白質(zhì)高。因此，一般添加劑的輔助作用在較低的蛋白質(zhì)濃度下（濃度下（0.1-lmg/mL0.1-lmg/mL）有效，在較高的蛋白質(zhì)濃）有效，在較高的蛋白質(zhì)濃度下由于分子間聚集的趨勢強烈，添加劑的作用不度下由于分子間聚集的趨勢強烈，添加劑的作用不明顯。明顯。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p 在生理環(huán)境下，低濃度蛋白質(zhì)的折疊可在生理環(huán)境下，低濃度蛋白質(zhì)的折疊可在數(shù)分鐘內(nèi)完成，一般不超過在數(shù)分鐘內(nèi)完成，一般不超過60m

58、in60min。但是，。但是，大部分添加劑在抑制聚集體生成的同時，也大部分添加劑在抑制聚集體生成的同時，也會抑制蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，造成折疊速率降會抑制蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，造成折疊速率降低。因此，在這類添加劑的存在下，由于復(fù)低。因此，在這類添加劑的存在下，由于復(fù)性速率較低，需要較長的復(fù)性時間（性速率較低，需要較長的復(fù)性時間（(5-40h)(5-40h)才能獲得較高的復(fù)性收率。因此，利用添加才能獲得較高的復(fù)性收率。因此，利用添加劑提高復(fù)性收率常需以延長復(fù)性操作時間為劑提高復(fù)性收率常需以延長復(fù)性操作時間為代價。代價。七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p在包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性中，若利用鹽酸在包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性中

59、，若利用鹽酸肌或尿素溶解包含體，應(yīng)首先考慮通過調(diào)節(jié)肌或尿素溶解包含體，應(yīng)首先考慮通過調(diào)節(jié)鹽酸胍或尿素的濃度來獲得滿意的復(fù)性效果。鹽酸胍或尿素的濃度來獲得滿意的復(fù)性效果。只有在復(fù)性效果不佳的情況下才考慮其他添只有在復(fù)性效果不佳的情況下才考慮其他添加劑。加劑。p 在后續(xù)的分離過程中表面活性劑類添在后續(xù)的分離過程中表面活性劑類添加劑的去除是必須考慮的問題。表面活性劑加劑的去除是必須考慮的問題。表面活性劑與蛋白質(zhì)結(jié)合作用較強，長時間作用還會引與蛋白質(zhì)結(jié)合作用較強，長時間作用還會引起蛋白質(zhì)變性，需要及時除去。離子型表面起蛋白質(zhì)變性，需要及時除去。離子型表面活性劑可用離子交換色譜去除?；钚詣┛捎秒x子交換色譜去除。 七、蛋白質(zhì)復(fù)性七、蛋白質(zhì)復(fù)性p5 5、分子伴侶或人工