凝膠電泳及Westernblot檢測技術(shù)ppt課件

1、 SDS-PAGE凝膠電泳及凝膠電泳及Western blot 檢測技術(shù)檢測技術(shù)SDS-PAGE凝凝膠電膠電泳泳實驗原理實驗原理實驗步驟實驗步驟本卷須知本卷須知電印跡電印跡SDS-PAGESDS-PAGE的優(yōu)點的優(yōu)點SDS-PAGESDS-PAGE的缺點的缺點實驗常見問題及處理實驗常見問題及處理小技巧小技巧實驗原理實驗原理l背景背景l(fā)基本原理基本原理l分類分類l分離范圍分離范圍l實驗中各成分作用實驗中各成分作用背景背景l(fā)1967年由Shapiro建立。l1969年由Weber和Osborn進一步完善。l 他們發(fā)現(xiàn)樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑SDS以后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于

2、亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視.丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-亞甲基雙丙烯酰胺亞甲基雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)過硫酸胺過硫酸胺(AP)(AP)激活作用激活作用激活作用激活作用共聚合共聚合基本原理之一基本原理之一l陰離子去污劑陰離子去污劑SDS破壞蛋白質(zhì)分子破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其它物質(zhì)分子之間的非共之間及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變其原有價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充分結(jié)合的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。復(fù)合物。l強還原劑巰基乙醇現(xiàn)在常用二巰強

3、還原劑巰基乙醇現(xiàn)在常用二巰基蘇糖醇，基蘇糖醇，DTT打開蛋白質(zhì)分子打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵使這種結(jié)合更加充分。內(nèi)的二硫鍵使這種結(jié)合更加充分。基本原理之二基本原理之二l結(jié)合了結(jié)合了SDSSDS的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長橢的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物其橢圓棒的短軸復(fù)合物其橢圓棒的短軸長度恒定，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大長度恒定，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。小成正比。l這樣的蛋白質(zhì)這樣的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物在電場作用下，其遷移復(fù)合物在電場作用下，其遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的率便不再受

4、蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根據(jù)這一特點，就可以將各蛋白組分按分子量大小據(jù)這一特點，就可以將各蛋白組分按分子量大小分開。分開。分類分類 PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類. 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)l不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。濃縮膠濃縮膠l濃縮膠的作用是

5、有堆積作用，凝膠濃度較小，濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。區(qū)帶。l當(dāng)樣品液和濃縮膠選當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris/HClTris/HCl緩沖液，電級液緩沖液，電級液選選Tris/Tris/甘氨酸。電泳開始后，甘氨酸。電泳開始后，HClHCl解離成氯離解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，

6、甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。濃縮膠濃縮膠l電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。l Gly- Pro- Cl-+分離膠分離膠l孔徑較小孔徑較小, ,通過選擇合適的凝膠濃度通過選擇合適的凝膠濃度, ,可以使樣品很好的分離可以使樣品很好的分離. .當(dāng)樣品當(dāng)樣品進入分離膠進入分離膠,pH,pH,凝膠孔徑改變凝膠孔徑改變, ,使慢離子的泳動率變大使慢離子的泳動率變大, ,超過蛋白超過蛋白, ,高高強度電

7、廠消失強度電廠消失. .因此蛋白在均一的因此蛋白在均一的pH,pH,和電場強度下通過分離膠和電場強度下通過分離膠. .如果如果蛋白質(zhì)分子量不同蛋白質(zhì)分子量不同, ,通過分離膠受到的阻力不同，泳動率也不同通過分離膠受到的阻力不同，泳動率也不同, ,因此因此能夠根據(jù)蛋白的分子量不同而分開能夠根據(jù)蛋白的分子量不同而分開. .l Pro1- Pro2 Gly- Cl-Pro1- Pro2 Gly- Cl-+ 積層膠分離膠 凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。在上下電泳槽內(nèi)充以Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)，這樣便形成了凝膠孔徑和緩沖液pH值的不連續(xù)性。在濃縮膠中 HCl幾乎全

8、部解離為Cl-，但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。蛋白質(zhì)的等電點一般在pH5左右，在此條件下其解離度在HCl和甘氨酸之間。當(dāng)電泳系統(tǒng)通電后，這3種離子同向陽極移動。其有效泳動率依次為Cl-蛋白質(zhì)H2NCH2COO-，故C1-稱為快離子，而H2NCH2COO- 稱為慢離子。濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)電泳開始后，快離子在前，在它后面形成離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。在快離子和慢離子之間形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面。由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子

9、之間被濃縮成一條狹窄帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。 樣品進入分離膠后，慢離子甘氨酸全部解離為負離子，泳動速率加快，很快超過蛋白質(zhì)，高電壓梯度隨即消失。此時蛋白質(zhì)在均一的外加電場下泳動，但由于蛋白質(zhì)分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質(zhì)的泳動速率不同而形成一條條區(qū)帶。分離膠內(nèi)的電荷分離膠內(nèi)的電荷效應(yīng)效應(yīng) 與與SDSSDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，在水溶液中在水溶液中SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似的形狀，使得的形狀，使得SDS-PAGESDS-PAGE電泳的泳動率不再電泳的泳動率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與形狀的影響。因而，受蛋白質(zhì)

10、原有電荷與形狀的影響。因而，各種各種SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳動率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。動率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。 但在SDS-PAGE電泳中，由于SDS這種陰離子表面活性劑以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子帶負電荷，這種負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別，從而降低或消除了蛋白質(zhì)天然電荷的差別； 此外，由多亞基組成的蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后都解離成亞單位注意SDS結(jié)合蛋白質(zhì)的前提條件是有還原劑DTT，就能更好結(jié)合），這是因為SDS破壞了蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵等非共價鍵。lSDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰

11、胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨 “甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而變小，比率接近 1：20 時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺為1：29 配制，試驗表明它能分離大小相差只有3% 的蛋白質(zhì)。分離范圍分離范圍l凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用用5 515%15%的丙烯酰胺

12、所灌制凝膠的線性分離范圍的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：如下表：丙烯酰胺濃度（丙烯酰胺濃度（% %）線性分離范圍線性分離范圍kDkD）1512431016687.536945.057212雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為 1：29電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移 經(jīng)過電泳分離后蛋白質(zhì)在凝膠中難于進行進一步分析 如氨基酸序列分析、氨基酸組成分析等，需將它們轉(zhuǎn)移至有一定韌性并且化學(xué)惰性的高分子支持物上,目前最常用的是PVDF(聚偏氟乙烯)一類膜，其中Perkin-Elmer公司提供的ProBlott膜具有吸附蛋白質(zhì)能力強的特性，特別適合于氨基酸組成分析和序列分析。 下面介紹兩種電印跡方法

13、。水浴式電印跡方法水浴式電印跡方法l（采用（采用Bio-Rad公司的公司的Mini-Protean III系列）系列）l1將轉(zhuǎn)移膜剪成和凝膠一樣大小。將轉(zhuǎn)移膜剪成和凝膠一樣大小。l2將將PVDF膜在膜在100%甲醇中均勻潤濕約甲醇中均勻潤濕約2-3秒），再在水中漂洗秒），再在水中漂洗2-3min，然后在轉(zhuǎn)移緩沖，然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少液中平衡至少15min。l3電泳結(jié)束后，將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡電泳結(jié)束后，將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 5min。l4將凝膠置于也在緩沖液中浸泡過的將凝膠置于也在緩沖液中浸泡過的Whatman 3mm濾紙上，然后將濾紙上，然后將PVDF膜覆于膜覆于凝膠上，再蓋上

14、一張浸濕的濾紙避免在每一凝膠上，再蓋上一張浸濕的濾紙避免在每一層間留有氣泡），最后將它們一起夾入轉(zhuǎn)移盒層間留有氣泡），最后將它們一起夾入轉(zhuǎn)移盒中。中。l5根據(jù)需要轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的分子量設(shè)定恒定根據(jù)需要轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的分子量設(shè)定恒定工作電流及轉(zhuǎn)移時間，一般分子量工作電流及轉(zhuǎn)移時間，一般分子量20 KD的蛋的蛋白質(zhì)從白質(zhì)從0.5mm厚的凝膠上轉(zhuǎn)移可設(shè)電壓厚的凝膠上轉(zhuǎn)移可設(shè)電壓50V，時間約需時間約需10-30min，分子量大的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移需，分子量大的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移需要的時間相應(yīng)增加，但是在實驗中可以發(fā)現(xiàn)，要的時間相應(yīng)增加，但是在實驗中可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量100KD時，即使轉(zhuǎn)移時，即使轉(zhuǎn)移

15、45-60min 膜上吸附的蛋白質(zhì)的量仍不理想。另外，膜上吸附的蛋白質(zhì)的量仍不理想。另外，如果用如果用Tris-甘氨酸緩沖液，電壓為甘氨酸緩沖液，電壓為40V，需，需1-4 h。l6轉(zhuǎn)移完畢后將膜去下在超純水中漂洗轉(zhuǎn)移完畢后將膜去下在超純水中漂洗23次，每次次，每次5min，以洗去膜上沾有的在電泳和電印跡過程中使用，以洗去膜上沾有的在電泳和電印跡過程中使用的緩沖液。的緩沖液。l如果用做氨基酸分析：轉(zhuǎn)移緩沖液首選如果用做氨基酸分析：轉(zhuǎn)移緩沖液首選 CAPS，這是，這是因為因為CAPS對以后的氨基酸組成分析、蛋白質(zhì)序列測定對以后的氨基酸組成分析、蛋白質(zhì)序列測定影響小，另外影響小，另外CAPS在在p

16、H 11時有很好的緩沖能力，并時有很好的緩沖能力，并保證絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶負電荷向正極移動。保證絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶負電荷向正極移動。lWestern blot：通常用：通常用Tris-甘氨酸系統(tǒng)也可以進行電印甘氨酸系統(tǒng)也可以進行電印跡，但轉(zhuǎn)移結(jié)束后需對膜漂洗更完全以去除可能沾附跡，但轉(zhuǎn)移結(jié)束后需對膜漂洗更完全以去除可能沾附的緩沖液離子及其他雜質(zhì)。的緩沖液離子及其他雜質(zhì)。半干式轉(zhuǎn)移半干式轉(zhuǎn)移（Semi-dry transfer） 1、將膜和濾紙剪成和凝膠相同大小。 2、準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移緩沖液。 陽極緩沖液陽極緩沖液：0.3M Tris,10%甲醇，甲醇， pH10.4;陽極緩沖液陽極緩沖液：25mM T

17、ris,10%甲醇，甲醇，pH10.4;陰極緩沖液：陰極緩沖液：25mM Tris, 40mM 6-氨基己酸，氨基己酸，10%甲醇，甲醇，pH9.4(也可以用也可以用40mM甘氨酸代替甘氨酸代替)。水浴式轉(zhuǎn)移用的水浴式轉(zhuǎn)移用的CAPS緩沖液：也可用于半干式轉(zhuǎn)移，但緩沖液：也可用于半干式轉(zhuǎn)移，但轉(zhuǎn)移效率不及上述系統(tǒng)，尤其當(dāng)?shù)鞍缀可跎贂r，希望轉(zhuǎn)移效率不及上述系統(tǒng)，尤其當(dāng)?shù)鞍缀可跎贂r，希望蛋白質(zhì)盡量多地轉(zhuǎn)移至膜上以便下一步分析。蛋白質(zhì)盡量多地轉(zhuǎn)移至膜上以便下一步分析。我們實驗室：我們實驗室：25mM Tris 192mM甘氨酸甘氨酸, 無無SDSl 3、將PVDF膜在100%甲醇中潤濕2-3 s

18、，再用超純水漂洗2-3min，然后在陽極緩沖液中平衡至少15min。l 4、電泳結(jié)束后將凝膠在陰極緩沖液中平衡5min。l5在轉(zhuǎn)移槽的陽極板上按以下順序放置：在陽在轉(zhuǎn)移槽的陽極板上按以下順序放置：在陽極緩沖液極緩沖液中浸過的中浸過的Whatman 3mm濾紙，濾紙，PVDF膜，凝膠，在陰緩沖液中浸過的膜，凝膠，在陰緩沖液中浸過的Whatman 3mm濾紙。濾紙。l6根據(jù)需轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的特性設(shè)置合適的電流及根據(jù)需轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的特性設(shè)置合適的電流及時間，一般原則為時間，一般原則為1.8mA/cm2, 1 h。由于半干式。由于半干式轉(zhuǎn)移不易散熱，電印跡宜在轉(zhuǎn)移不易散熱，電印跡宜在4環(huán)境中進行冰環(huán)境中進行

19、冰柜或冰庫中）。柜或冰庫中）。l7轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜在超純水中漂洗轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜在超純水中漂洗23次，次，每次每次5min，除去，除去Tris和甘氨酸。然后將膜置于和甘氨酸。然后將膜置于濾紙上將其自然晾干后，再在濾紙上將其自然晾干后，再在20%甲醇溶液稍甲醇溶液稍微潤濕一下即可在白光如日光燈下看到灰微潤濕一下即可在白光如日光燈下看到灰白色的蛋白質(zhì)帶印跡，因而可省去染色步驟，白色的蛋白質(zhì)帶印跡，因而可省去染色步驟，切下此印跡進一步分析。但是當(dāng)電泳前樣品中切下此印跡進一步分析。但是當(dāng)電泳前樣品中含有較多的雜蛋白及鹽時，用此法不易分辨，含有較多的雜蛋白及鹽時，用此法不易分辨，仍需染色。仍需染色。實驗

20、中各成分作用實驗中各成分作用l聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺lSDSl甘氨酸甘氨酸l上樣緩沖液上樣緩沖液l固定液固定液l染色劑染色劑l 被激活的單體和未被激活的單體反應(yīng)開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機地通過bis的作用進行交叉互聯(lián)成為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終多聚物聚合成凝膠狀，而其孔徑大小等特征由聚合條件及單體濃度決定。十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉(SDS)l SDS是陰離子型表面活性劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物，再與PAGE技術(shù)結(jié)合，則譜帶差異更加明顯、明晰，并可測定蛋白質(zhì)分子量。l SDS帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過白質(zhì)

21、結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或了蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，因而可利用分子量的差異將各電荷，因而可利用分子量的差異將各種蛋白質(zhì)分開。種蛋白質(zhì)分開。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000200,000之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 為蛋白質(zhì)的分子量，m R 為相對遷移率，b為斜率，K為截距。當(dāng)條件一定時，b與K均為常數(shù)。 因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比

22、較，就可以得出未知蛋白的分子量。 樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界邊界, ,而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域, , 它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。甘氨酸甘氨酸l 此處此處pH值較高，值較高， 有利于甘氨酸的離子化，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解氯

23、離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。大小得到分離。上樣緩沖液上樣緩沖液為什么要上樣緩沖液？為什么要上樣緩沖液？蛋白上樣緩沖液蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一種以溴酚藍為染料，是一種以溴酚藍為染料，5倍濃縮的倍濃縮的SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白電泳樣品上樣。蛋白電泳樣品上樣。本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的

24、巰基可使蛋白分子的本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和使用時請務(wù)必注明，仔細區(qū)分。上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和使用時請務(wù)必注明，仔細區(qū)分。l本卷須知本卷須知l 分為還原型和非還原型兩種，分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中含一定量的還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT或巰基乙醇，有輕微刺激性氣或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分；味，較易區(qū)分；l 含巰基的試劑有一定的毒性，含巰基的試

25、劑有一定的毒性，為了您的安全和健康，請穿實驗服為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。并戴一次性手套操作。使用說明使用說明 1. 1.按每按每4 l4 l蛋白樣品加入蛋白樣品加入1l1l蛋白上樣緩沖液蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)(5X)。 2.2.100100或沸水浴加熱或沸水浴加熱3 35min5min，以充分變性蛋，以充分變性蛋白。白。 3.3.冷卻到室溫后離心數(shù)秒鐘如果長時間離心冷卻到室溫后離心數(shù)秒鐘如果長時間離心會導(dǎo)致甘油分層，需要重新混勻），混均后再離會導(dǎo)致甘油分層，需要重新混勻），混均后再離30 30 s

26、s，取上清直接上樣到，取上清直接上樣到SDS-PAGESDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。膠加樣孔內(nèi)即可。 4.4.通常電泳時染料到達膠的底端附近通常電泳時染料到達膠的底端附近0.5 0.5 1cm)1cm)即可停止電泳。即可停止電泳。 增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。 上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴散出來到電泳緩沖液中。 指示劑檢測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿 。 單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使

27、用兩種混和的固定液。驗中使用兩種混和的固定液。CarnoyCarnoy固定液甲醇固定液甲醇: :冰乙酸冰乙酸=3:l=3:l每次使用前需臨時配制，長時間放置影每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間響固定效果，固定時間15min15min至至24 h24 h，冰箱、室溫均，冰箱、室溫均可?？伞?甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液甲醇：有固定、硬化和脫水的作用。甲醇：有固定、硬化和脫水的作用?？梢怨潭ò椎鞍?、球蛋白、核蛋可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但對核蛋白固定效果較差白，但對核蛋白固定效果較差( (親親和力小且易自溶和力小且易自溶) )。冰醋酸：純醋酸在溫度稍變低時即冰醋酸：

28、純醋酸在溫度稍變低時即形成冰晶，所以又稱為冰醋酸。形成冰晶，所以又稱為冰醋酸。常用常用0.30.30.50.5的濃度作為固定的濃度作為固定液。冰醋酸對材料有膨脹作用，液。冰醋酸對材料有膨脹作用，對核蛋白固定好，可與水、酒精、對核蛋白固定好，可與水、酒精、氯仿混合。氯仿混合。 染色劑染色劑l 考馬斯亮藍染色考馬斯亮藍染色l常用染色方法常用染色方法 銀染法銀染法l 金屬離子染色法金屬離子染色法5電泳操作） 將聚合好的凝膠板安置于電泳槽中，上樣，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M行電泳。 垂直板垂直板電泳裝置電泳裝置加樣加樣樣品遷樣品遷移方向移方向水平式電泳裝置水平式電泳裝置電泳緩沖液電泳緩沖液凝膠凝膠 水平電泳裝置

29、水平電泳裝置電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。個帶孔膠粒?；旌蠘悠坊旌蠘悠穾Э啄z帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子夾在兩塊玻璃夾在兩塊玻璃板之間的凝膠板之間的凝膠 電泳電泳緩沖液緩沖液 電泳電泳緩沖液緩沖液 加在槽中的經(jīng)加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品處理的樣品分子量小分子量小分子量大分子量大電源電源染色和脫色染色和脫色 電泳完畢需通過染色和脫色評定其結(jié)果的優(yōu)劣，此外根據(jù)不同的研究目的，也可將凝膠直接進行

30、放射自顯影及電印跡。電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后的凝膠照片脫色后的凝膠照片.結(jié)果處理結(jié)果處理 l1 1測量并計算分子量現(xiàn)在已經(jīng)很少用到）測量并計算分子量現(xiàn)在已經(jīng)很少用到）l蛋白質(zhì)的分子量與它的電泳遷移有一定關(guān)系式，經(jīng)蛋白質(zhì)的分子量與它的電泳遷移有一定關(guān)系式，經(jīng)3737種蛋白的測定得到種蛋白的測定得到以下的關(guān)系式以下的關(guān)系式l Mw Mw K(10 K(10bm) (1)bm) (1)l lgMw = lgK lgMw = lgKbm = K1bm = K1bm (2)bm (2)l 其中其中MWMW是蛋白質(zhì)分子量；是蛋白質(zhì)分子量；K K和和K1K1為常數(shù)為

31、常數(shù)l b b為斜率，為斜率，m m是電泳遷移率，實際使用的是相對遷移率是電泳遷移率，實際使用的是相對遷移率mRmR。lmR=dpr/dBPB mR=dpr/dBPB l2 2灰度掃描和分析灰度掃描和分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。鏈分子量。 相對遷移率相對遷移率實驗注意事項實驗注意事項 1. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好

32、壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：丙烯酰胺、線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。2. 注意不能隨便傾倒單體溶液，應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。l3. TEMED中混有氧化試劑后其自身中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。加用量以保證聚膠速度。l4. 過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解

33、于水后很快降解失去催化能力，因于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時過硫酸銨不易外在配制凝膠溶液時過硫酸銨不易過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠主要指天然無變性劑凝膠)。l5. 激活劑的用量激活劑的用量: 激活劑的濃度適激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過度，也將影響凝膠

34、的質(zhì)量。增加過硫酸銨或硫酸銨或TEMED的用量，將使丙的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時，聚合鏈長度過短，至一定程度時，聚合鏈長度過短，將不會形成肉眼可見的凝膠，這些將不會形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。較聚合前高一些。 6. 溫度的影響聚膠的最佳溫度為2325 ，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有時從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫

35、后脫去氧氣的速度較低溫時快。 7. 氧氣的影響氧氣會與被激活的單體自由基作用氧氣的影響氧氣會與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得到最佳充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度聚合效果。通常在較好的真空度(125torr)脫氣脫氣至少至少15 min 。 8.凝膠添加劑：凝膠中常常加入凝膠添加劑：凝膠中常常

36、加入SDS、尿素、尿素、TritonX-100等添加劑。等添加劑。SDS加入后不會對加入后不會對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。多肽。 9. 聚膠時間：雖然應(yīng)用過硫酸銨TEMED催化后灌膠1520 min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90 min才能保證95以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時聚膠時間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進行分離，對孔徑大小要求不高，因此不必等很長時間(完全聚合需8 h)。10. 單體的濃度：是指單體總重

37、量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可選擇的范圍為330，單體濃度增加后聚合速度將加快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。 11. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例即：1.4g SDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。l12. 用用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且作為下次用。并且SDS-PAGE測定分測定分子量有子量有10誤差，不可完全信任。誤差，不可完全信任。l13. 有的蛋白質(zhì)如：電荷異?；蚪Y(jié)有的蛋

38、白質(zhì)如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)不能采用該法測相對分子量。白質(zhì)不能采用該法測相對分子量。14. 有些蛋白質(zhì)由亞基如血紅蛋白有些蛋白質(zhì)由亞基如血紅蛋白或兩條以上肽鏈或兩條以上肽鏈-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶組成的，它們在巰基乙醇和組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因而，用下解離成亞基或多條單肽鏈。因而，對于這一類蛋白質(zhì)，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量?；蚴菃螚l肽鏈的相對分子量。 常見問題及處理辦法常見問題及處理辦

39、法 紋理和拖尾現(xiàn)象 由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。電泳時間比正常要長電泳時間比正常要長可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯誤。選擇錯誤。 指示劑成微笑符號指示劑前沿呈現(xiàn)向上的指示劑成微笑符號指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。5.凝膠時間不對凝膠時間不對 通常膠在通常膠在30min內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，

40、可內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，可能是能是TEMED，APS劑不夠或者失效劑不夠或者失效l6.呈現(xiàn)呈現(xiàn)“皺眉皺眉”（兩邊向下中間鼓起）（兩邊向下中間鼓起）l主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。l7.7.呈現(xiàn)呈現(xiàn)“鬼帶鬼帶” ” 如何處理？如何處理？l “ “鬼帶鬼帶就是在跑大分子構(gòu)就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端有時在濃縮膠中的一些泳道頂端有時在濃縮

41、膠中的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進入分離膠。但標(biāo)條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在在WBWB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后

42、，再添加適量的后，再添加適量的DTTDTT或或BetaBeta巰基乙醇，巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量以補充不足的還原劑；或可加適量EDTAEDTA來阻止還原劑的氧化。來阻止還原劑的氧化。l 8.為什么溴酚藍不能起到指示作用？ l 我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。SDS-PAGE的優(yōu)點的優(yōu)點l設(shè)備簡單l快速l分辨率和靈敏度高 l特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測定 SDS-PAGE的缺點的缺點 1. 有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因而，對于這一類的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。 SDS-PAGE的缺點的缺點l2. 還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)如組蛋白F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多