人臍血間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及向成骨細胞分化的研究

1、人臍血間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及向成骨細胞分化的研究                                       作者：農(nóng)丕地，黃海玲，解繼勝  【摘要】  目的 擬建立一套較為

2、簡便、有效和實用的人臍血間充質(zhì)干細胞（MSCs）體外分離培養(yǎng)體系，探討其向成骨細胞分化的可行性。方法 由人臍靜脈血獲得MSCs，純化培養(yǎng)后用含地塞米松、-甘油磷酸鈉和維生素C的培養(yǎng)液誘導，通過倒置顯微鏡觀察、堿性磷酸酶染色檢測誘導后細胞。結(jié)果 來源于臍血的單個核細胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后出現(xiàn)形態(tài)學上可見間充質(zhì)樣的細胞，間充質(zhì)樣細胞為類似成纖維細胞樣的細胞形態(tài)。誘導培養(yǎng)的細胞堿性磷酸酶染色呈陽性。結(jié)論 人臍血MSCs經(jīng)合理的體外誘導培養(yǎng)后，可以分化為成骨細胞。 【關(guān)鍵詞】  胎血 間質(zhì)干細胞 成骨細胞 細胞分化 地塞米松 -甘油磷酸鈉 Abstract:  Objecti

3、ve  To establish a more simple, effective and practical isolation and culture system for human umbilical cord blood (HUCB)-derived mesenchymal stem cells (MSCs), and investigate the feasibility of turning them into osteoblasts.  Methods  MSCs isolated from HUCB with Percoll density gr

4、adient solution were culture-expanded because the cells attached and grew on dishes, then MSCs were subcultured in a condition medium including dexamethasone, vitamin C and ?-glycerophosphate. An inverted microscope, immunocytochemical staining for alkaline phosphatase (ALP) were applied to observe

5、the MSCs proliferation capability and osteogenic property.  Results  The HUCB-derived mononuclear cells, when placed in culture, gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-like or mesenchymal-like phenotype. The MSCs in induced culture showed  immunocytochemical

6、staining for ALP.  Conclusion  The HUCB-derived MSCs can be cultured and differentiated into osteoblasts in vitro.   Key words:  fetal blood; mesenchymal stem cells; osteoblasts; cell differentiation; dexamethasone;  ?-glycerophosphate臍血(human umbilical cord blood,HUCB)

7、是胎兒出生時臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細胞和祖細胞。目前研究證實臍血中存在的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在一定條件下進行體外培養(yǎng)和誘導分化后能成為神經(jīng)細胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞)、心肌細胞、軟骨細胞14，可作為細胞治療新的種子細胞和基因治療新的載體細胞。隨著組織工程學研究的深入，對于相關(guān)功能細胞研究逐漸擴展到干細胞領(lǐng)域，MSCs對骨組織修復有重要意義，本實驗主要探索人臍血MSCs分離培養(yǎng)及分析其向成骨細胞分化的可行性。1  材料與方法1.1  材料 主要試劑和儀器：Dulbecco改良培養(yǎng)基(DME

8、M)，胎牛血清（HYCLONE公司）；-甘油磷酸鈉、地塞米松（美國SIGMA公司）；Percoll分離液(PHARMACIA公司)；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（博士德公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；CO2培養(yǎng)箱（SHELDONA公司）；AE31型倒置顯微鏡（MOTIC公司）。1.2  方法1.2.1  臍血MSCs的分離培養(yǎng) 從胎盤臍靜脈穿刺抽取15ml臍血，肝素抗凝，加等量磷酸緩沖液稀釋，取50ml離心管，先加入15ml密度1.077g/ml的Percoll梯度分離液，小心加入稀釋后的臍血，2000r/min離心25min后，用吸管吸取分層界面的白色環(huán)形絮狀物（

9、富含單個核細胞），800r/min離心洗滌2次，5min/次，沉積細胞用含15胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細胞密度為1×109/L，接種于25T的培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置在37、體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育72h后更換培養(yǎng)基，去除紅細胞及其他未貼壁細胞，以后視細胞生長情況平均三四天換液1次。1.2.2  臍血MSCs的傳代培養(yǎng) MSCs約于7周相互匯合達培養(yǎng)瓶底7080的生長表面，此時進行傳代培養(yǎng)。倒掉舊培養(yǎng)基，加入2ml 0.25的胰酶消化，作用30s后棄掉大部分，留置少許于瓶中，適當用力振蕩培

10、養(yǎng)瓶，整瓶細胞放入培養(yǎng)箱中5min，在倒置顯微鏡下觀察細胞解離程度，以細胞突起縮回、細胞間隙增大、細胞近乎圓形為度，加入含15胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕柔吹打瓶底，收集細胞，800r/min離心洗滌2次，每次5min，接種于置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。1.2.3  MSCs誘導培養(yǎng) 取第56代細胞按密度為5×104/ml接種于6孔培養(yǎng)板(孔內(nèi)置無菌蓋玻片)中，第2天換液，其中半數(shù)培養(yǎng)孔用誘導成骨培養(yǎng)液(5FCS的DMEM含10mmol/L-甘油磷酸鈉；10nmol/L地塞米松；50mg/L維生素C)進行培養(yǎng)，隔日換培養(yǎng)液1次，并觀察細胞形態(tài)特征

11、。1.2.4  成骨細胞檢測1.2.4.1  形態(tài)學觀察 誘導后，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，特別注意其形態(tài)的改變，記錄可見變化特征及其出現(xiàn)時間，拍照。                             1.2.4.2  ALP染色 誘導培養(yǎng)56天的細胞長

12、滿玻片時，取出玻片，用10%中性福爾馬林溶液固定，按ALP試劑盒說明書行ALP免疫組化染色。對照染色，以正常羊血清替代一抗進行免疫組織化學染色。2  結(jié)果2.1  細胞形態(tài)學觀察 臍血間充質(zhì)干細胞接種24h，僅見少量梭形貼壁細胞，近似圓形或短梭形，48h后貼壁細胞逐漸增多，細胞漸變長，3天后換液除去絕大部分懸浮細胞，可見分散的間充質(zhì)干細胞小集落，集落細胞呈放射狀生長。隨著培養(yǎng)時間延長細胞集落逐漸增大，細胞形態(tài)呈長梭形，2周后細胞集落彼此融合，呈旋渦狀或菊花狀生長。傳代后3周細胞基本融合成層（見圖1）。MSCs經(jīng)誘導培養(yǎng)后，細胞形態(tài)由長梭形漸變?yōu)槎噙呅位蛄⒎叫巍⑷?/p>

13、形(見圖2)。2.2  ALP免疫組化染色 可見胞漿中出現(xiàn)大量棕褐色顆粒（見圖3）。對照染色細胞胞漿未見著色。3  討論骨組織工程的種子細胞來源主要有成骨細胞和MSCs等。成骨細胞雖然具有良好的成骨活性，但來源有限，大量分離獲取困難，體外大量擴增的潛力不足，故不能滿足骨組織工程臨床應用的需要；MSCs不僅具有良好的成骨細胞分化潛能和高成骨活性，而且具有強大的增殖潛能。目前，MSCs主要來源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且隨著年齡增長其細胞數(shù)量和擴增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢，故尋找一種能替代骨髓MSCs，并可彌補其缺陷的間充質(zhì)干細胞來源，已

14、越來越受到各國學者的關(guān)注。HUCB是胎兒出生時臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細胞，主要包含造血干細胞和MSCs。臍血中的MSCs可在體外培養(yǎng)，誘導分化后能成為神經(jīng)細胞、心肌細胞14等。與骨髓相比，臍血有更充足的來源，臍帶血中干細胞含量豐富，明顯超過成人外周血含量，相當或超過成人骨髓中的含量5。由于MSCs具有多方向分化潛能，如何定向誘導其成骨分化是解決骨組織工程中種子細胞來源的一個前提。本實驗采用Rosada等6描述的成骨誘導方法，即用地塞米松、維生素C和-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在傳代的MSCs中加入誘導劑后，細胞逐漸增大，細胞形態(tài)由長梭形漸變?yōu)槎噙呅位蛄⒎叫巍?/p>

15、三角形，隨著誘導時間的延長，細胞逐漸匯合呈鋪路石狀，形態(tài)向成骨細胞方向轉(zhuǎn)化。ALP是成骨細胞分化成熟的重要標志，是參與骨組織形成、代謝及再生的重要物質(zhì)，ALP能水解有機磷酸酶，使局部磷酸根濃度增高，而且可破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化，完成基質(zhì)礦化過程，發(fā)揮在體外鈣化過程中的關(guān)鍵性作用。本實驗經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)后的MSCs，ALP染色為陽性，而相應對照組均為陰性。這證明用地塞米松、維生素C和-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導培養(yǎng)MSCs后具有成骨活性，即相當一部分MSCs經(jīng)過誘導培養(yǎng)后已經(jīng)誘導為成骨細胞，我們的研究結(jié)果與許多學者研究結(jié)果一致6,7。    本實驗證實從人臍血中獲取MS

16、Cs，在條件培養(yǎng)液誘導下，短期內(nèi)可獲得大量有成骨能力的細胞，該細胞具有明確的成骨生物學活性，是種子細胞的理想來源。骨科臨床上，創(chuàng)傷和骨病等引起的大段骨缺損的修復一直是個棘手的難題。最佳方法是自體骨移植，但對于大段骨缺損而言，存在取骨量有限和取骨處創(chuàng)傷的問題；而異體骨移植則有免疫排斥反應等缺陷，并有傳播疾病的潛在風險。用組織工程學的方法構(gòu)建人工骨是目前的研究熱點。其基本思路是將具有成骨潛能的種子細胞結(jié)合到人工骨支架材料，在骨生長因子的作用下生成新骨用于臨床。因此尋找合適的種子細胞，提高組織工程化人工骨的成骨效能具有重大意義。【參考文獻】  1Hou L, Cao H, Wang D,

17、et al. Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro J. Int J Hematol,2003,78(3):256-261.2候玲玲，曹華，魏國榮,等.人臍血間充質(zhì)干細胞體外擴增和向神經(jīng)元樣細胞定向誘導分化的研究J.中華血液雜志,2002，23（8）：415-419.3Kadner A, Hoerstrup SP, Tracy J, et al. Human umbilical cord cells: a new cell source for cardi

18、ovascular tissue engineering J. Ann Thorac Surg,2004,74(4):1422-1428. 4農(nóng)丕地,解繼勝,黃海玲.體外誘導人臍帶血間充質(zhì)干細胞為軟骨細胞的初步研究J.右江民族醫(yī)學院學報,2007,29(5):689-691.5沈柏鈞.人類臍血基礎(chǔ)與臨床M.天津：天津科學技術(shù)出版社，2000:157-176.6Rosada C, Jus tesen J, Melsvik D, et al. The human umbilical cord blood: a potential source for osteoblast progenitor cells J. Calcif Tissue Int,20