水稻抽穗期QTL DTH2的圖位克隆和功能分析

1、水稻抽穗期 QTL DTH2 的圖位克隆和功能分析#吳瑋勛1，江玲1，鐘錚錚2，陸廣文1，萬(wàn)建民1*51015202530（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）摘要：開(kāi)花時(shí)間（作物中指抽穗期）是決定生長(zhǎng)季節(jié)和植物適應(yīng)特定自然環(huán)境的地區(qū)適應(yīng)性的重要生態(tài)性狀。水稻是起源于熱帶地區(qū)的短日作物。本文鑒定了一個(gè)在長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)抽穗的微效數(shù)量性狀位點(diǎn) DTH2，并對(duì)其進(jìn)行了分子克隆?；パa(bǔ)和 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí) DTH2編碼一個(gè) CONSTANS-like 蛋白。DTH2 蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)并具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，

2、并且DTH2 的表達(dá)受節(jié)律鐘調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)成花素基因 Heading Date 3a (Hd3a) 和 RICEFLOWERING LOCUS T 1 (RFT1) 來(lái)促進(jìn)抽穗，并且獨(dú)立于已知的開(kāi)花集成子 Heading date 1(Hd1) 和 Early heading date 1 (Ehd1)，體現(xiàn)了微效 QTLs 在作物育種中起重要作用。關(guān)鍵詞：水稻；DTH2 克??；抽穗期；功能分析中圖分類號(hào)：S511.S330.2+5Map-based cloning and function analysis of QTL DTH2 forheading date in rice (O

3、ryza sativa L.)WU Weixun1, JIANG ling1, ZHONG Zhengzheng2, LU Guangwen1, WAN Jianmin1(1. State Lab of Crop Genetics and Germplasm Ehancement, Nanjing Agricultural University,NanJing 210095;2. Cro Science Institute, CAAS, Beijing 100081)Abstract: Flowering time (heading date in crops) is an important

4、 ecological trait that determinesgrowing seasons and regional adaptability of plants to specific natural environments. Rice (Oryzasativa L.) is a short-day plant that originated in the tropics. We report here the molecular cloningand characterization of DTH2, a minor-effect quantitative trait locus

5、(QTL) that promotes headingunder long-day conditions (LDs). Complementary test and RNA interference assay confirmed thatDTH2 encodes a CONSTANS (CO)-like protein. DTH2 protein is targeted to the nucleus and hastranscriptional activation activity and DTH2 expression is regulated by the circadian cloc

6、k. Weshow that DTH2 promotes heading by inducing the florigen genes Heading Date 3a (Hd3a) andRICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1), and it acts independently of the known floralintegrators Heading date 1 (Hd1) and Early heading date 1 (Ehd1), demonstrating an importantrole of minor-effect QTLs in crop ad

7、aptation and breeding.Keywords: Rice; DTH2 cloning; Heading date; Function analysis350 引言成功的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)依賴于作物更好地適應(yīng)于當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境和栽培范圍的擴(kuò)張，主要取決于合適的開(kāi)花時(shí)間（在水稻中開(kāi)花時(shí)間指抽穗）1。光周期敏感性使?fàn)I養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂虮徽J(rèn)為是使作物適應(yīng)特異的生態(tài)條件和環(huán)境變異從而決定開(kāi)花時(shí)間的最重要的因40子1,2。在合適的生長(zhǎng)條件下，延遲抽穗使作物擁有更長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，從而促進(jìn)更多資源的積累和分配至種子生產(chǎn)，然而短的或不可預(yù)知的生長(zhǎng)季節(jié)則對(duì)生育期短的物種有利3。資源分配和壓力避免之間的

8、權(quán)衡對(duì)于作物的產(chǎn)量和質(zhì)量是特別重要的3。利用擬南芥（長(zhǎng)日照植物）和水稻（短日照植物），開(kāi)花時(shí)間的分子機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了深基金項(xiàng)目：教育部博士點(diǎn)基金（20090097110011）作者簡(jiǎn)介：吳瑋勛，（1985-），男，博士研究生，水稻分子遺傳學(xué)。通信聯(lián)系人：萬(wàn)建民，（1960-），男，教授，水稻遺傳育種。E-mail: wanjm-1-入的研究。在對(duì)擬南芥的開(kāi)花相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)有四種主要途徑參與開(kāi)花調(diào)控，分別是光周期途4550556065707580徑，春化途徑，自主開(kāi)花途徑和赤霉素途徑4，其中最重要的是光周期途徑。在擬南芥中，GIGANTEA (GI) CONSTANS (CO) FLOWERING

9、LOCUS T (FT)是一條主要的長(zhǎng)日照促進(jìn)開(kāi)花通路5-10，這些基因在水稻中分別有相應(yīng)的同源基因，組成水稻中的促進(jìn)開(kāi)花的通路為OsGIHd1Hd3a11-15。與擬南芥不同，該通路在水稻中僅在短日照下促進(jìn)開(kāi)花，因?yàn)樵陂L(zhǎng)日照條件下，Hd1 抑制 Hd3a 的表達(dá)，導(dǎo)致開(kāi)花延遲14。目前的研究表明水稻的抽穗由 Hd3a（水稻短日照下的主要成花素）和 RFT1（Hd3a 的同源基因，水稻長(zhǎng)日照下的主要成花素）促進(jìn)16,17。在這些成花素基因的上游基因中，Hd1和 Ehd1 作為兩個(gè)主要的開(kāi)花信號(hào)集成者，接受來(lái)自其它基因的多種信號(hào)，如 OsGI, RID1,Ehd3, OsMADS50, OsMA

10、DS51, Ghd7, 和 DTH8，來(lái)調(diào)控成花素基因的表達(dá)2,12,14,18-27。這些開(kāi)花時(shí)間基因的克隆為進(jìn)一步深入了解水稻的開(kāi)花途徑具有重要的借鑒意義。在本研究中，我們克隆了一個(gè)微效 QTL，DTH2，在 LD 下誘導(dǎo)開(kāi)花而在 SD 下沒(méi)有效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)該基因?qū)τ诖龠M(jìn)水稻在長(zhǎng)日照下開(kāi)花起重要作用。1 材料與方法1.1 水稻材料和生長(zhǎng)條件以 Asominori（Aso，粳稻）為背景親本和 IR24（秈稻）為供體親本的染色體片段置換系 CSSL23，攜帶有來(lái)源于 IR24 的 DTH2 基因。為了進(jìn)一步減少 CSSL23 中的來(lái)自 IR24 的插入片段，我們篩選出了一個(gè)以 Aso 為背景，

11、包含 DTH2 位點(diǎn)的 9.6-cM（厘摩）來(lái)自 IR24片段的 nearly isogenic line (NIL)。該 IR24 片段限定于第二染色體 SSR 標(biāo)記 RM318 和 RM240之間。Aso 和 NIL 種植在北京自然長(zhǎng)日照條件(Natural long-day conditions, NLDs, 116.4° E,39.9 ° N, day length > 15 h), 海南自然短日照條件(Natural short-day conditions, NSDs, 110.0°E, 18.5° N, day length <

12、 12 h), 光照培養(yǎng)箱控制的短日照條件（Controlled short-day conditions,CSDs, 10h 光, 30°C/14h 暗, 25°C），光照培養(yǎng)箱控制的長(zhǎng)日照條件（Controlled long-dayconditions, CLDs, 14h 光, 30°C/10h 暗, 25°C）。光照培養(yǎng)箱用熒光燈照明（300mol m-2 s-1），濕度為 70%。1.2 種子成熟度統(tǒng)計(jì)在 NLDs 和 NSDs 條件下，Aso 抽穗后 60 天后，取 Aso 和 NIL 的穗子脫粒后根據(jù)種皮的顏色來(lái)判斷種子的成熟度。即統(tǒng)計(jì)黃色

13、糙米在所有糙米中的比例，統(tǒng)計(jì)兩個(gè)穗子，取平均值作為該單株的成熟度。1.3 載體構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化根據(jù)預(yù)測(cè)的候選基因序列，以 Aso 序列為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增 DTH2 全基因組（引物見(jiàn)附表 1）獲得了一個(gè) 7867bp 的 DNA 片段，該片段包括 4049bp 的上游啟動(dòng)子序列，全長(zhǎng)編碼區(qū)，1543bp 下游序列。使用日本 Takara 公司的 In-FusionTM Advantage PCR CloningKits（ pCAMBIA1305.1 的 Sma I位點(diǎn)，構(gòu)建 pDTH2-a:DTH2-a 質(zhì)粒。pDTH2-a:DTH2-a 質(zhì)粒的翻譯起始位點(diǎn)處正好有一個(gè)Nco I 酶切位點(diǎn)，1

14、305 質(zhì)粒的 GUS 基因翻譯起始位點(diǎn)處也有一個(gè) Nco I 酶切位點(diǎn)，因此用Nco I 酶切 pDTH2-a:DTH2-a 質(zhì)粒移除 DTH2 的編碼區(qū)和 CaMV 35S 啟動(dòng)子，之后用 T4 DNA連接酶使載體自連以形成 pDTH2-a:GUS 載體。通過(guò)引物（附表 1）使用 Warthmann 等28-2-報(bào)道的方法擴(kuò)增一段包含 DTH2 人工 miRNA 序列的 261bp 片段，通過(guò)同源重組的方法把該片段重組至 pCAMBIA2300 的 Xma位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建 RNAi 載體。通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法將上述構(gòu)建的雙元載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株 EHA105，然后通過(guò)農(nóng)桿菌介8590951001051

15、10115導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化。把 pDTH2-a:GUS 載體，干擾載體和干擾空載體轉(zhuǎn)化入 Aso 的愈傷中，把全長(zhǎng)互補(bǔ)載體和全長(zhǎng)互補(bǔ)空載體轉(zhuǎn)入 NIL 的愈傷中。陽(yáng)性的 pDTH2-a:GUS 轉(zhuǎn)基因植株篩選后進(jìn)行 GUS 染色29，用體視鏡(Leica DFC420)拍照。1.4 亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄自激活活性分析首先用引物（附表 1）擴(kuò)增沒(méi)有終止密碼子的 DTH2-a CDS 片段，然后通過(guò)同源重組的方法把該片段重組至 pAN580 的 Bam HI位點(diǎn)。使用 PEG 介導(dǎo)的方法將 DTH2-a-GFP 融合蛋白和核 marker OsMADS3-mCherry 共定位于水稻葉片原生質(zhì)

16、體中30,31。GFP 檢測(cè)用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS-SP4）進(jìn)行觀察。轉(zhuǎn)錄自激活實(shí)驗(yàn)用 Matchmaker GAL4 Two-HybridSystem 3 (Clontech)進(jìn)行。首先用引物（附表 1）擴(kuò)增 DTH2-a CDS 和各種缺失片段，然后通過(guò)同源重組的方法把該片段重組至 pGBKT7 的 Eco RI位點(diǎn)，并使各片段分別與 GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域完全融合，最終構(gòu)建如下 5 個(gè)載體：BD-DTH2-a，BD-ZF，BD-MR，BD-CCT和 BD-ZF/CCT。所有 5 個(gè)載體和空載體都轉(zhuǎn)化入酵母菌株 AH109。轉(zhuǎn)錄自激活活性分析使用 Clontech 公司

17、的 Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 進(jìn)行。-半乳糖活性的測(cè)定根據(jù) Clontech 的 操 作 手 冊(cè) 進(jìn) 行 ( 略 有 修 改 ) ， 用 液 體 培 養(yǎng) 的 方 法 ， 使 用 chlorophenolred-D-galactopyranoside (CPRG; Roche Biochemicals) 作為反應(yīng)底物。1.5 節(jié)律表達(dá)材料的種植與取樣為了研究 DTH2 在 Aso 和 NIL 中的節(jié)律表達(dá)情況，在光照培養(yǎng)箱控制的長(zhǎng)日照條件（Controlled long-day conditions, CLDs, 14h 光, 30°C/1

18、0h 暗, 25°C）和光照培養(yǎng)箱控制的短日照條件（Controlled short-day conditions, CSDs, 10h 光, 30°C/14h 暗, 25°C）下都種植 Aso 和NIL，每種條件下種植 3 盆。每盆分兩半，使每盆都有 Aso 和 NIL，保證種植條件一致。在CLDs 下 68 天，CSDs 下 36 的時(shí)候，開(kāi)始取樣，每四小時(shí)取一次樣，取水稻植株的次新葉，每次取三株，取完后迅速裝袋然后放入液氮中速凍使材料保持新鮮，一共取 48h。用第一天取 的 材 料 來(lái) 研 究 其 它 基 因 如 Hd3a, RFT1, Hd1, Ehd1,

19、 OsMADS14, OsMADS15,RID1/OsId1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7 和 DTH8 在 Aso 和 NIL 中的表達(dá)情況。各種用于節(jié)律表達(dá)分析的開(kāi)花時(shí)間 NILs，或野生型和相應(yīng)的突變體材料包括 Hd1 的NILs，Ehd1 的 NILs，Tohoku IL9/ehd2 突變體，Tohoku IL9/ehd3 突變體，Dongjin/osmads50突變體，Dongjin/osmads51 突變體，Ghd7 的 NILs 和 DTH8 的 NILs 種植在 CLDs。在第 49天的暗期后 2h 取樣，分別收集 3 株苗的次新葉。

20、RNA 提取使用 QIAGEN 公司的 RNeasy PlantMini Kit，略有修改。RT-PCR 用 QIAGEN 公司的 QuantiTect® Reverse Transcription Kit，略有修改。Quantitative RT-PCR 用 TaKaRa 的 SYBR® Premix Ex TaqTM Kit，20l 反應(yīng)體系。在 Applied Biosystems 的 ABI PRISM 7900HT Real-time PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)。水稻 UBQ 基因(LOC_Os03g13170)作為內(nèi)參。Quantitative RT-PCR 的引物序

21、列見(jiàn)附表 1，數(shù)據(jù)用相對(duì)定量的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)32。-3-2 結(jié)果與分析1201251301351401452.1 DTH2 的精細(xì)定位本實(shí)驗(yàn)室之前的研究利用一個(gè)來(lái)源于 Asominori（Aso，粳稻）和 IR24（秈稻）的重組自交系（RILs）群體，連續(xù) 5 年在第二染色體長(zhǎng)臂末端標(biāo)記 C601 附近檢測(cè)到一個(gè)微效抽穗期 QTL33，名為 qDTH-2（QTL for Days to heading on chromosome 2, 在此研究中命名為DTH2）。為了研究 DTH2 在抽穗期中的遺傳效應(yīng)，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)以 Aso 為背景，包含DTH2 位點(diǎn)的 9.6-cM 來(lái)自 IR24 插入片

22、段的 NIL。在北京自然長(zhǎng)日照條件下（NLDs，日長(zhǎng)>15 h），和 Aso 比相比，NIL 延遲 7.4 天抽穗，但在海南自然短日照條件下（NSDs，日長(zhǎng)<12 h）差異不顯著（圖 1A,B）。在受控制的長(zhǎng)日照條件下(CLDs，14 h light/10 h dark) NIL也比 Aso 晚抽穗，而在受控制的短日照條件下(CSDs，10 h light/14 h dark)差異也不顯著（圖1B）。另外我們發(fā)現(xiàn)在 NLDs 下，當(dāng)種子收獲的時(shí)候，有 81.5%的 Aso 種子能成熟，而只有28.6%的 NIL 種子能成熟，71.4%的種子都是青的。相反的，在 NSDs 下，收獲后

23、所有來(lái)自Aso 和 NIL 的種子都能成熟（圖 1C,D）。這些結(jié)果也證明來(lái)自 Aso 的等位基因能更好地適應(yīng) NLDs 以形成生殖適應(yīng)。遺傳分析表明，Aso 和 NIL 雜交形成的 F2 群體中早抽穗和晚抽穗的分離比大約為 3:1（3213:1099, 2 = 0.55, P = 0.46），表明 DTH2 是一個(gè)單孟德?tīng)栆蜃?。我們?F2 衍生家系（F2:3）的平均表型值來(lái)鑒定抽穗期，我們選擇了 1099 個(gè)晚抽穗的純合家系，最終將 DTH2 定位在 dcaps3 和 dcaps5 之間的 37.6Kb 的區(qū)間內(nèi)（圖 1E）。圖1 兩個(gè)親本的表型和DTH2的圖位克隆。（A）Aso和NIL在

24、北京NLDs下的表型，照片拍攝于Aso抽穗的時(shí)候。（B）兩個(gè)親本在四種不同條件下的抽穗期。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示。（C）NLDs下，Aso抽穗后60天時(shí)收獲的來(lái)自Aso和NIL的糙米。（D）Aso和NIL在NLDs和NSDs下的種子成熟百分率。（E）DTH2的圖位克隆。底部顯示DTH2編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及Aso (DTH2-a)和NIL (DTH2-i)等位基因之間的自然變異。長(zhǎng)方形和線分別代表外顯子和內(nèi)含子。P代表雙尾T測(cè)驗(yàn)的P值，實(shí)驗(yàn)所用的植株數(shù)顯示在柱子中。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示。Fig. 1 Phenotypes of the parental lines, map

25、-based cloning of DTH2. (A) The phenotype of Aso and NIL under NLDs in Beijing.Photo was taken at the Aso heading stage. (B) Days to heading of the parental lines under four different conditions. (C) Thebrown rice of Aso and NIL from panicles sampled 60 days after Aso heading under NLDs. (D) Seed ma

26、turity percentage of Asoand NIL under NLDs and NSDs. (E) Map-based cloning of DTH2. The bottom diagram shows the coding region structure ofDTH2 and natural variation between the Aso (DTH2-a) and NIL (DTH2-i) alleles. Rectangles and lines represent exons andintrons, respectively. P represents P value

27、 from two-tailed t-test. Numbers of the plants used in the study are indicated in thecolumns. Data are presented as mean ± standard error (s.e.m.).-4-2.2 轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證150155160165170175為了證明 ORF5 是目的候選基因，我們構(gòu)建了一個(gè)包含 7867bp（包括 4049bp 上游序列，ORF5 全長(zhǎng)，1543bp 下游序列）來(lái)自 Aso 的片段的載體 pDTH2-a:DTH2-a，轉(zhuǎn)入 NIL 中。我們進(jìn)行了兩次獨(dú)

28、立的轉(zhuǎn)化，分別獲得了 25 和 60 株獨(dú)立的 T0 轉(zhuǎn)基因植株，種植在北京 NLDs下。通過(guò)轉(zhuǎn)基因鑒定其中分別有 23 和 39 株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。結(jié)果顯示和空載體相比，轉(zhuǎn)基因植株的抽穗期明顯提前。于是我們經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測(cè)隨機(jī)挑選兩株單拷貝的 T0 植株，收種后種植成兩個(gè) T1 家系，隨后我們又種植了兩個(gè)純合 DTH2-a 轉(zhuǎn)基因的 T3 家系（#18-7-2和#26-1-4），發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)家系的平均抽穗期比空載體提前，種子成熟度也比空載體顯著提高（圖 2A）。另外，我們構(gòu)建了 RNA 干擾（RNAi）載體，準(zhǔn)備干擾 Aso 中的 DTH2-a。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，我們找到了兩個(gè)純合的 T3

29、干擾家系（#5-4-2 和#38-37-4）。和空載體相比，轉(zhuǎn)基因植株的抽穗期明顯延遲，種子成熟度也明顯降低，表型和空載體-NIL (EV-N)相似（圖2B）。因此我們認(rèn)為 ORF5 就是 DTH2。圖2 T3互補(bǔ)和干擾轉(zhuǎn)基因植株的表型和分子鑒定。T3轉(zhuǎn)基因家系包括空載體-NIL (EV-N)， 互補(bǔ) (#18-7-2和#26-1- 4)，空載體-Aso (EV-A)， 和 RNAi (#5-4-2和#38-37-4) 在NLDs下的照片（A），抽穗期（B）和種子成熟度（C）。P1 和P2分別表示互補(bǔ)和EV-N植株之間，RNAi和EV-A植株之間的雙尾T檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中

30、用到的植株數(shù)在柱子中顯示，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示。Fig. 2 The phenotype and molecular identification of T3 transgenic plants of complementation and RNAi. Thephoto (A), days to heading (B), and seed maturity percentage (C) of T3 transgenic lines including emptyvector-NIL (EV-N), complementation (#18-7-2 and #26-1-4), e

31、mpty vector-Aso (EV-A), and RNAi (#5-4-2 and#38-37-4) under NLDs. P1 and P2 indicate two-tailed t-test and Wilcoxon signed-rank test results between co-mplementation and EV-N plants, RNAi and EV-A plants, respectively. Numbers of the plants used in the study areindicated in the columns. Data are pre

32、sented as mean ± standard error (s.e.m.).2.3 DTH2 的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄自激活活性分析為了確定 DTH2 蛋白的亞細(xì)胞定位，我們?nèi)诤狭?DTH2-a 的全長(zhǎng) CDS 和 GFP，DTH2-a-GFP 融合蛋白和一個(gè)核標(biāo)簽共定位在水稻葉片原生質(zhì)體中（圖 3A-D）。說(shuō)明 DTH2蛋白定位在細(xì)胞核中。進(jìn)一步，轉(zhuǎn)錄自激活活性實(shí)驗(yàn)表明 DTH2 在酵母中有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄自激活活性（圖 3E）。缺失分析表明存在于鋅指結(jié)構(gòu)域和 CCT 結(jié)構(gòu)域中間的區(qū)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄活性是必須的（圖 3E）。這些結(jié)果表明 DTH2 在細(xì)胞核中的基因表達(dá)調(diào)控中存在重要作用。-5-

33、180185190195200205210圖3 DTH2的亞細(xì)胞定位。（A）DTH2-a-GFP融合蛋白在細(xì)胞核中，（B）核標(biāo)記（OsMADS3-mCherry），（C）明場(chǎng)，（D）融合圖片。比例尺為7.5 um。（E）DTH2在酵母的GAL4系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄自激活活性實(shí)驗(yàn)和缺失分析。BD是GAL4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ZF，MR和CCT分別表示DTH2的鋅指區(qū)域，中間區(qū)域和CCT結(jié)構(gòu)域；EV表示空載體負(fù)對(duì)照。-半乳糖(-gal)活性通過(guò)液體培養(yǎng)的方法測(cè)定。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。Fig. 3 Subcellular localization of DTH2. (A) D

34、TH2-a-GFP fusion protein in the nuclei, (B) a nuclear marker(OsMADS3-mCherry), (C) bright field, and (D) the merged image. Scale bar represents 7.5 um. (E)Transactivation activity assay of DTH2 and its deletion derivatives in the yeast GAL4 system. BD is GAL4-DNAbinding domain; ZF, MR, and CCT indic

35、ate the zinc finger region, the middle region, and the CCT domain ofDTH2, respectively; EV denotes empty vector negative control. The -galactosidase (-gal) activity was measuredusing a liquid culture assay. The mean ± standard deviation (s.d.) was collected from three independentexperiments.2.4

36、 DTH2 的時(shí)空表達(dá)模式分析為了檢測(cè) DTH2 的時(shí)間和空間表達(dá)模式，我們用實(shí)時(shí)定量 PCR（qRT-PCR）對(duì)來(lái)自 Aso的各組織中檢測(cè) DTH2 的表達(dá)水平。在所有組織中都檢測(cè)到 DTH2 的表達(dá)，但在葉片和葉鞘中的表達(dá)最豐富（圖 4A）。另外 qRT-PCR 的結(jié)果也表明 DTH2-a 和 DTH2-i 表現(xiàn)相似的表達(dá)水平和模式。在 CLDs 和 CSDs 下，它們的表達(dá)在黎明后 8 小時(shí)開(kāi)始積累，黃昏后 2 小時(shí)達(dá)到高峰，之后開(kāi)始降低（圖 4B,C）。圖4 DTH2的時(shí)空表達(dá)模式分析。(A) DTH2-a在自然長(zhǎng)日照條件下的組織特異表達(dá)模式。在CLDs (B)和CSDs(C)下，DT

37、H2-a 和DTH2-i 等位基因節(jié)律表達(dá)模式的qRT-PCR分析。開(kāi)放和封閉的柱子分別代表光期和暗期。表達(dá)水平用水稻Ubiquitin (UBQ)基因作內(nèi)參。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，三次技術(shù)重復(fù)和兩次生物學(xué)重復(fù)。Fig. 4 The temporal and spatial expression pattern analysis of DTH2. (A) Tissue-specific expression pattern ofDTH2-a under NLDs. qRT-PCR analysis of the diurnal expression patterns of DT

38、H2-a and DTH2-i alleles underCLDs (B) and CSDs (C). The open and filled bars represent light and dark periods, respectively. The expressionlevel is shown as a ratio with the rice Ubiquitin (UBQ) gene. The mean ± s.d. was obtained from three technicalrepeats and two biological repeats.2.5 DTH2 通

39、過(guò)上調(diào) Hd3a 和 RFT1 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)抽穗我們通過(guò)比較一些光周期相關(guān)基因在 Aso 和 NIL 之間的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在 CLDs 下，兩個(gè)成花素基因 Hd3a 和 RFT1，在 Aso 中的表達(dá)水平比在 NIL 中的高，但在 CSDs 下幾乎一致（圖 5A,B,E,F）。相似的，僅在 CLDs 下，下游開(kāi)花相關(guān)基因 OsMADS14 和 OsMADS15-6-在 NIL 中的表達(dá)下降（圖 5C,D,G,H）。215220225230隨后我們檢測(cè) DTH2 調(diào)控 Hd3a 和 RFT1 是否由 Hd1 或 Ehd1 介導(dǎo)，然而在 Aso 和 NIL之間 Hd1 或 Ehd1 的表達(dá)沒(méi)有顯著

40、差異（圖 6A,B）。另外，在攜帶有無(wú)功能的 hd1 或 ehd1等位基因的 NILs 中，DTH2 的表達(dá)與其在相應(yīng)的野生型植株中的表達(dá)相似（圖 7A,B）。這些結(jié)果表明 DTH2 對(duì)于成花素基因的效應(yīng)獨(dú)立于 Hd1 和 Ehd1。同理，其它 Hd1 和 Ehd1 的調(diào)節(jié)子，如 RID1/OsID1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51,Ghd7 和 DTH8 的表達(dá)也不受 DTH2 的影響（圖 6A,B）。相似的，DTH2 的表達(dá)也不受這些開(kāi)花調(diào)節(jié)子的影響（圖 7C-H）。因此，DTH2 可能是一個(gè)新的在 LD 下誘導(dǎo)開(kāi)花，獨(dú)立于Hd1 和 Ehd1 的開(kāi)花集成基因

41、。圖 5 在 CLDs (AD)和 CSDs (EH)下，Hd3a，RFT1，OsMADS14 和 OsMADS15 在 Aso 和 NIL 中節(jié)律表達(dá)模式的 qRT-PCR 分析。開(kāi)放和封閉的柱子分別代表光期和暗期。表達(dá)水平用水稻 UBQ 基因作內(nèi)參。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，三次技術(shù)重復(fù)和兩次生物學(xué)重復(fù)。Fig. 5 qRT-PCR analysis of Hd3a, RFT1, OsMADS14, and OsMADS15 diurnal expression patterns in Aso and NILunder CLDs (AD) and CSDs (EH). The

42、open and filled bars represent the light and dark period, respectively.The expression level is shown as the ratio with the rice UBQ gene. The mean ± s.d. was obtained from threetechnical repeats and two biological repeats.-7-圖 6 在 CLDs (A) 和 CSDs (B) 下，Hd1，Ehd1，RID1/OsId1/Ehd2，Ehd3，OsMADS50，OsM

43、ADS51，Ghd7和 DTH8 在 Aso 和 NIL 節(jié)律表達(dá)模式的 qRT-PCR 分析。開(kāi)放和封閉的柱子分別代表光期和暗期。表達(dá)水235240平用水稻 UBQ 基因作內(nèi)參。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，三次技術(shù)重復(fù)和兩次生物學(xué)重復(fù)。Fig. 6 qRT-PCR analysis of Hd1, Ehd1, RID1/OsId1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7 and DTH8diurnal expression patterns in Aso and NIL under CLDs (A) and CSDs (B). The open b

44、ars and the filled barsrepresent light period and dark period, respectively. The expression levels are shown as the ratio with the rice UBQgene. The mean ± s.d. was obtained from three technical repeats and two biological repeats.-8-圖 7 在 CLDs 下，DTH2 在各種開(kāi)花時(shí)間 NILs 和它們的野生型和相應(yīng)的突變體中的表達(dá)水平。(A) 日本晴(Ni

45、p, 包含有功能 Hd1 等位基因)和 NIL (hd1, 包含無(wú)功能 Hd1 等位基因), (B) NIL (Ehd1, 包含有功能 Ehd1等位基因) 和 T65 (ehd1, 包含無(wú)功能 Ehd1 等位基因), (C)Tohoku IL9 和 ehd2 突變體, (D) Tohoku IL9 和 ehd3245250255260265270275突變體, (E) Dongjin 和 osmads50 突變體, (F) Dongjin 和 osmads51 突變體, (G) NIL(Ghd7, 包含來(lái)自明恢 63的有功能 Ghd7 等位基因)和 NIL(ghd7, 包含來(lái)自珍秈 97 的無(wú)

46、功能 Ghd7 等位基因), (H) Aso (包含有功能DTH8 等位基因)和 CSSL61 (dth8, 包含無(wú)功能 DTH8 等位基因)。樣品取自 49 天植株的次新葉，暗期后 2小時(shí)開(kāi)始取樣，取 3 株。表達(dá)水平用水稻 UBQ 基因作內(nèi)參。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，三次技術(shù)重復(fù)和兩次生物學(xué)重復(fù)。Fig. 7 The expression levels of DTH2 in various flowering-time NILs or their WTs and corresponding mutantsunder CLDs. (A) Nipponbare (Nip, wit

47、h a functional Hd1 allele) and NIL (hd1, with a non-functional Hd1 allele),(B) NIL (Ehd1, with a functional Ehd1 allele) and T65 (ehd1, with a non-functional Ehd1 allele), (C)Tohoku IL9and ehd2 mutant, (D) Tohoku IL9 and ehd3 mutant, (E) Dongjin and osmads50 mutant, (F) Dongjin and osmads51mutant, (

48、G) NIL(Ghd7, with a functional Ghd7 allele from Minghui63) and NIL(ghd7, with a non-functional Ghd7allele from Zhenshan97), (H) Aso (with a functional DTH8 allele) and CSSL61 (dth8, with a non-functional DTH8allele). Penultimate leaves were collected 2 hours after the dark period from 49-d-old plant

49、s and three plants wereharvested. The expression levels are shown as the ratio with the rice UBQ gene. The mean ± s.d. was obtainedfrom three technical repeats and two biological repeats.3 討論本研究中，我們用圖位克隆的方法克隆了 DTH2 基因，研究表明 DTH2 編碼一個(gè) CO-like蛋白。CO-like 基因家族成員在許多植物的光周期調(diào)控開(kāi)花途徑中起重要作用，而且在雙子葉和單子葉植物中高度保

50、守34,35。擬南芥和水稻基因組分別有 17 個(gè)和 19 個(gè) CO-like 基因34。有意思的是，之前的研究表明兩個(gè) CO-like 基因，Hd1 和 Ghd7，在水稻中 LD 下負(fù)調(diào)控開(kāi)花，然而 Hd1 有另一個(gè)功能即在 SDs 下促進(jìn)開(kāi)花12,25。另外，水稻 Hd1/Ghd7 在小麥和大麥中的同源物（TaHd1/VRN2 和 HvCO1/HvVRN2）也參與開(kāi)花調(diào)控36-39。進(jìn)化分析表明 DTH2 和擬南芥 COL9 基因表現(xiàn)高度的序列一致性40。擬南芥 COL9 在 LDs 下通過(guò)抑制 CO 和 FT 的表達(dá)從而抑制開(kāi)花40，然而本研究中我們發(fā)現(xiàn) DTH2 在 LDs 下促進(jìn)水稻開(kāi)

51、花。因此，DTH2和 COL9 在水稻和擬南芥中可能通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)控光周期開(kāi)花。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在 LDs 下，DTH2 通過(guò)誘導(dǎo) Hd3a 和 RFT1 表達(dá)來(lái)促進(jìn)抽穗，但獨(dú)立于兩個(gè)開(kāi)花集成基因 Hd1 和 Ehd1。因此，DTH2 可能是一個(gè)新的開(kāi)花集成子。一個(gè)來(lái)自臺(tái)灣的栽培稻 T65 中的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持該現(xiàn)象，T65 同時(shí)包含無(wú)功能的 Hd1 和 Ehd1 等位基因但在 SDs 和 LDs 下都能抽穗18。我們發(fā)現(xiàn) T65 包含 DTH2-a 等位基因，并且在 Ehd1 的NILs 中 DTH2 的表達(dá)水平?jīng)]有差異（圖 7B）。進(jìn)一步，我們構(gòu)建了 T65/NIL F2 群體包含200

52、0 個(gè)單株，從中分離出了 16 株 hd1/ehd1/DTH2-i 三突變體，我們發(fā)現(xiàn)三突變體比 T65 抽-9-穗晚。因此，DTH2 是一個(gè)新的開(kāi)花集成子，獨(dú)立于 Hd1 和 Ehd1 在長(zhǎng)日條件下促進(jìn)開(kāi)花。關(guān)于這點(diǎn)，有意思的是最近在水稻中發(fā)現(xiàn)了另一個(gè) CO-like 基因 OsCO3 和開(kāi)花相關(guān)，該基因在 SDs 下抑制開(kāi)花。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因也獨(dú)立于 Hd1 和 Ehd1，通過(guò)負(fù)調(diào)控 Hd3a 來(lái)抑制抽穗41。2802854 結(jié)論本文鑒定了一個(gè)在長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)抽穗的微效數(shù)量性狀位點(diǎn) DTH2，并對(duì)其進(jìn)行了分子克隆?；パa(bǔ)和 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí) DTH2 編碼一個(gè) CONSTANS-l

53、ike 蛋白。DTH2 蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)并具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，并且 DTH2 的表達(dá)受節(jié)律鐘調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)成花素基因 Heading Date 3a (Hd3a) 和 RICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1) 來(lái)促進(jìn)抽穗，并且獨(dú)立于已知的開(kāi)花集成子 Heading date 1 (Hd1) 和 Early heading date 1 (Ehd1)，體現(xiàn)了微效 QTLs 在作物育種中起重要作用。致謝感謝臺(tái)灣中興大學(xué) Tsai Kuo Hai 教授，韓國(guó)浦項(xiàng)大學(xué) Gynheung An 教授，日本國(guó)立農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究所 Masahiro Yano 教授和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)提供本研究中用到的各種材料。290參考文獻(xiàn) (References)1 YAMA