重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠

1、重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠Chongzu Niu Jianxing Chengxianwei Xibao Shengzhangyinzi NingjiaoRecombinant Bovine Basic Fibroblast Growth Factor Gel本品系由高效表達(dá)牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后，加入凝膠基質(zhì)制成。含適宜穩(wěn)定劑、防腐劑，不含抗生素。1.基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合現(xiàn)行版中國藥典三部“凡例”的有關(guān)要求。2 制造2.1 工程菌菌種2.1.1名稱及來源重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子工程菌株系由帶有牛堿性成

2、纖維細(xì)胞生長因子基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.1.2 種子批建立應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.3 菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項全面檢定。2.1.3.1 劃種LB瓊脂平板應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。2.1.3.2染色鏡檢應(yīng)為典型的革蘭氏陰性桿菌。2.1.3.3 對抗生素的抗性應(yīng)與原始菌種相符。2.1.3.4 電鏡檢查（工作種子批可免做）應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.3.5 生化反應(yīng)應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1.3.6 牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)量在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)

3、量。2.1.3.7 質(zhì)粒檢查該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.1.3.8目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）目的基因核苷酸序列應(yīng)與批準(zhǔn)序列相符。2.2 原液制備2.2.1 種子液制備將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.2.2 發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含抗生素的培養(yǎng)基。2.2.3 種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。在適宜溫度下進(jìn)行發(fā)酵，應(yīng)采用經(jīng)批準(zhǔn)的發(fā)酵工藝，并確定相應(yīng)的發(fā)酵條件，如溫度、PH值、溶氧、補(bǔ)料、發(fā)酵時間等。2.2.4 發(fā)酵液處理用適宜的方法處理菌體。2.2.5 純化采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行純化，使其

4、達(dá)到3.1項要求，即為牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子原液。加入穩(wěn)定劑，除菌過濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.6 原液檢定按3.1項進(jìn)行。23 半成品制備采用的基質(zhì)應(yīng)符合凝膠劑基質(zhì)要求（附錄I M）。2.3.1配制與除菌應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的配方進(jìn)行。2.3.2凝膠制備應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行。凝膠劑應(yīng)均勻、細(xì)膩，在常溫時保持膠狀，不干涸或液化。2.3.3半成品檢定按3.2項進(jìn)行。2.4 成品2.4.1 分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2 分裝應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.4.3 規(guī)格應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.4.4 包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程” 和附錄I M的有關(guān)規(guī)定。3 檢定3

5、.1 原液檢定3.1.1 生物學(xué)活性依法測定（附錄X G）。3.1.2 蛋白質(zhì)含量依法測定（附錄VI B 第二法）。3.1.3 比活性 為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg 蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.7×105IU。 3.1.4 純度3.1.4.1 電泳法依法測定（附錄IV C）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0，加樣量應(yīng)不低于10g（考馬斯亮藍(lán)R250染色法）或5g（銀染法）。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0。 3.1.4.2 高效液相色譜法依法測定（附錄III B）。色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以A相（三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加

6、水至1000ml，充分混勻）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻）為流動相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫（070%B相）。上樣量不低于10mg，于波長280nm處檢測，以牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子色譜峰計算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000，按面積歸一化法計算，牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.0%。3.1.5 分子量依法測定（附錄IV C）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0，加樣量應(yīng)不低于1.0g，制品兩條蛋白帶的分子質(zhì)量應(yīng)分別為17.5kD+1.875kD和22.0kD+2.20kD。3.1.6 外源性D

7、NA殘留量每1支應(yīng)不高于10ng（附錄 IX B）。 3.1.7 等電點主區(qū)帶應(yīng)為9.010.0,供試品的等電點與對照品的等電點圖譜一致（附錄IV D）。3.1.8 紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100g/ml500g/ml，在光路1cm、波長230nm360nm下進(jìn)行掃描,最大吸收峰波長應(yīng)為277±3nm（附錄II A）。3.1.9 肽圖（每半年測定一次） 依法測定(附錄VIII E),應(yīng)與對照品圖形一致。 3.2 半成品檢定3.2.1 生物學(xué)活性應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品，依法測定（附錄 X G ），應(yīng)符合規(guī)定。3.2.2無菌檢查應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品，依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。3.3 成品檢定除外觀、裝量檢查外，應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品后，進(jìn)行其余各項檢定。3.3.1 鑒別試驗按免疫印跡法（附錄VIII A）或免疫斑點法（附錄VIII B）測定，應(yīng)為陽性。3.3.2 物理檢查3.3.2.1 外觀 應(yīng)為無色透明凝膠。3.3.2.2 裝量依法檢查(附錄V F)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3.3 pH值按經(jīng)批準(zhǔn)的方法對樣品進(jìn)行預(yù)處理,應(yīng)為6.57.5（附錄V A）。（按1：5的比例用水對凝膠進(jìn)行稀釋）3.3.4 生物學(xué)活性按經(jīng)批準(zhǔn)的方法對樣品進(jìn)行預(yù)處理，應(yīng)為標(biāo)示量的70%200%（附錄X