米糠蛋白提取工藝優(yōu)化及分離純化kdh

1、FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年第35卷第5期 Extracting and purification of rice bran proteinBAI Li,YANG Zhong-liang,JIE Wei-guang(Heilongjiang Oriental College,Harbin 150080Abstract:Rice bran protein as a new type of protein resources is widely used to improve food nutrition andstructures.Cell wall enzy

2、mes on the extraction of rice bran protein plays an important role,selects cellulose is the best enzyme and determines the best dosage of enzyme and optimum reaction conditions.In optimum conditions,the protein extraction rate is 43.93%.And successively by DEAE -52anion -exchange and SephadexG -75ge

3、l filtration chromatography purifies the crude rice bran protein,SDS -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGEtests the effective of purification,the relative molecular of the protein is 20.0ku.Key words:rice bran protein;extracting;purification;molecular白莉,楊忠亮,接偉光(黑龍江東方學(xué)院,哈爾濱150080摘要:米糠蛋白作為一種新型

4、蛋白質(zhì)資源,廣泛用于改善食品的營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)。細(xì)胞破壁酶類(lèi)對(duì)米糠蛋白提取有重要作用,從中選取纖維素酶為最佳酶類(lèi),并確定了該酶的最佳用量以及最適反應(yīng)條件,在最適條件下,蛋白提取率為43.93%。并先后經(jīng)DEAE-52陰離子交換及SephadexG-75凝膠過(guò)濾層析對(duì)米糠粗蛋白進(jìn)行純化,SDS-聚丙烯胺電泳(SDS-PAGE檢測(cè)純化效果明顯,為相對(duì)分子量20.0ku 的一種蛋白質(zhì)。關(guān)鍵詞:米糠蛋白;分離;純化;分子量中圖分類(lèi)號(hào):Q 503文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1005-9989(201005-0173-04米糠蛋白提取工藝優(yōu)化及分離純化收稿日期:2009-08-26作者簡(jiǎn)介:白莉(1980,碩士,講

5、師,研究方向?yàn)樯c分子生物學(xué)。米糠是稻谷脫殼后依附在糙米上的表面層,是一種廉價(jià)、利用率低但營(yíng)養(yǎng)豐富的稻米加工副產(chǎn)品。中國(guó)是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó),年產(chǎn)量約為1.85億t ,米糠作為大米加工的副產(chǎn)品,可利用資源相當(dāng)豐富1,但米糠的綜合開(kāi)發(fā)利用及相應(yīng)理論研究仍處于較低水平。米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值雖高,但過(guò)去僅作為飼料應(yīng)用,造成極大的浪費(fèi),如能將米糠中的蛋白質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)成分提取出來(lái),經(jīng)濟(jì)效益將非?？捎^2。因此尋找一種米糠蛋白的最佳水解提取工藝,探索一種實(shí)用、高效的米糠蛋白的分離、純化方法是十分必要的。并測(cè)定其分子量,為進(jìn)一步研究米糠蛋白的結(jié)構(gòu)和組成提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為深度開(kāi)發(fā)米糠產(chǎn)品帶來(lái)巨

6、大經(jīng)濟(jì)效益作良好鋪墊。1材料與方法1.1材料·173· 新鮮粗米糠(蛋白質(zhì)含量約為14.0%,經(jīng)60目篩子除雜質(zhì),向過(guò)篩米糠中以16的比例加入乙醚石油醚(11的混合液,室溫下攪拌3h,4000r/min 離心10min,沉淀在通風(fēng)櫥中室溫晾干,得脫脂米糠為實(shí)驗(yàn)材料。1.2方法1.2.1米糠蛋白的提取脫脂米糠5g加緩沖液50mL(料液比110適當(dāng)溫度攪拌加酶反應(yīng)一定時(shí)間滅酶(60、30min離心(3000r/min、30min收集上清液測(cè)蛋白質(zhì)含量。1.2.2細(xì)胞破壁酶選擇利用細(xì)胞破壁酶處理,可以降解植物細(xì)胞壁的纖維素成分,使細(xì)胞壁內(nèi)有效成分釋放,提高細(xì)胞內(nèi)蛋白的提取率。根據(jù)

7、表1比較蛋白質(zhì)提取率,從中選出最佳細(xì)胞破壁酶。1.2.3米糠蛋白的純化DE-52纖維素陰離子交換層析初步純化:DE-52纖維素經(jīng)0.05mol/L Tris-HCl(pH7.1平衡緩沖液室溫平衡24h后裝柱,在裝柱過(guò)程中不斷攪拌使得柱床面平整。用平衡緩沖液平衡12h,流速為3mL/min4。將3mL米糠蛋白粗提液緩慢上樣,先用平衡緩沖液以3mL/min的流速洗脫,編號(hào)收集各蛋白。沖洗至基線后,接著用含0.1mol/L NaCl、0.5mol/ L NaCl的平衡緩沖液分段洗脫5,編號(hào)收集流出液。測(cè)OD280,電泳檢測(cè)。取濃度最高的峰,合并相應(yīng)管,備用。Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析柱再

8、次純化: Sephadex G-75用0.05mol/L Tris-HCl(pH7.1平衡緩沖液15平衡后裝柱,將經(jīng)纖維素DE-52層析純化后合并的樣品上樣。以0.05mol/L Tris-HCl (pH7.1平衡緩沖液0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫6。編號(hào)收集各蛋白,每管收集3mL,沖洗至基線后則停止。分別測(cè)OD280,有兩個(gè)吸收峰。蛋白質(zhì)樣品濃度的測(cè)定:大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm波長(zhǎng)處最大光吸收,這是由于蛋白質(zhì)中有Tyr、Trp和phe存在的緣故,利用這個(gè)特征性吸收,可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量7。如果沒(méi)有干擾物的存在,在280nm處的吸收可用于測(cè)定0.10.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純

9、化的蛋白質(zhì)常含有核酸,核酸在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收。有核酸時(shí),所測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當(dāng)校正,一般按下述公式計(jì)算:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL=1.45A280-0.74A260SDS-PAGE測(cè)純化蛋白相對(duì)分子量以及純化結(jié)果:借鑒生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)8。2結(jié)果與分析2.1細(xì)胞破壁酶的選擇為了比較各種細(xì)胞壁酶對(duì)蛋白質(zhì)提取的效果,篩選出合適的提取用酶,分別采用-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶對(duì)米糠進(jìn)行水解,比較蛋白質(zhì)提取率,結(jié)果如表2所示。添加不同的細(xì)胞破壁酶均可以提高米糠中蛋白的提取率。由于米糠細(xì)胞壁的主要成分為纖維類(lèi)物質(zhì),它們與一些蛋白質(zhì)通過(guò)氫鍵緊密纏繞在一起,阻礙了酶的水解作用,使這些蛋白質(zhì)無(wú)法溶出。而

10、其他成分含量較少,因此纖維素酶對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響最高,對(duì)于米糠是一種較好的細(xì)胞破壁酶。2.2纖維素酶提取米糠蛋白的單因素分析2.2.1pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響采用pH單因素實(shí)驗(yàn),選用不同的pH對(duì)米糠進(jìn)行水解,其他作用條件為:溫度50,S=10%,E/S=2%,時(shí)間2 h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。在pH4.05.0范圍內(nèi),隨pH的升高,蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì),在pH5.0時(shí),蛋白質(zhì)提取率最大,為43.93%。隨后再隨pH值的升高,蛋白質(zhì)提取率基本沒(méi)有多大變化。2.2.2溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響采用溫度單因素實(shí)驗(yàn),選用不同溫度對(duì)米糠進(jìn)行水解,其他作用條件為:pH5.0,S=10%,E/S=2%,時(shí)

11、間2 h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。米糠淀粉的糊化溫度為5861,為防止淀粉表1不同細(xì)胞破壁酶水解條件酶的種類(lèi)pH溫度/E/S/%S/%時(shí)間/h 空白對(duì)照-502102-淀粉酶 6.0502102纖維素酶 5.0502102果膠酶 4.0352102表2不同細(xì)胞破壁酶對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響酶類(lèi)蛋白質(zhì)提取率/%空白對(duì)照12.79a-淀粉酶37.85纖維素酶43.93果膠酶30.73表3pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0提取率/%38.4242.3143.9341.1140.29·174·FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年

12、第35卷第5期 表7纖維素DE-52陰離子交換層析樣品蛋白含量合并的樣品合并后命名總體積/mL OD 260OD 280蛋白質(zhì)量/mg 8184C 119 2.468 2.48333.7066130、131C 25.51.6141.3674.3328在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中糊化溶出,提取溫度應(yīng)控制在50以下。從表4中可以看出,纖維素酶的最適作用溫度50,所以酶解溫度應(yīng)控制在4550,以便充分發(fā)揮酶的活力。2.2.3酶用量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響采用酶用量單因素實(shí)驗(yàn),選用不同酶用量對(duì)米糠進(jìn)行水解,其他作用條件為:pH5.0,溫度50,S=10%,時(shí)間2h ,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。在米糠蛋白提取過(guò)程中,添加適

13、量的纖維素酶可以提高蛋白質(zhì)的提取率。當(dāng)添加量為由1%增加到2%時(shí),蛋白質(zhì)提取率增幅很大,當(dāng)從2%到3%時(shí),隨添加量的增加,蛋白質(zhì)提取率反而下降,可能隨添加量的增加,溶解在米糠水解液中的可溶性纖維含量也有所增加,導(dǎo)致最終的蛋白質(zhì)提取率下降。當(dāng)添加量由3%增加到5%時(shí),蛋白質(zhì)提取率只有緩慢的增加,所以2%為纖維素酶的最適添加量。2.2.4時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響采用時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn),選用不同時(shí)間對(duì)米糠進(jìn)行水解,其他作用條件分別為:pH5.0,溫度50,S=10%,E/S=2%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。在米糠蛋白提取過(guò)程中,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)的提取率呈增加趨勢(shì)。當(dāng)時(shí)間為2h 時(shí),蛋白質(zhì)的提取率為43.

14、93%,雖然34h 能加大提取率但效果不明顯,從節(jié)約時(shí)間和能源的角度看選擇2h 為最適反應(yīng)時(shí)間。2.3米糠蛋白的分離純化2.3.1粗蛋白的纖維素DE-52陰離子交換層析純化米糠蛋白粗提液經(jīng)纖維素DE-52陰離子交換層析柱分離時(shí),因?yàn)槊卓返鞍自趐H7.1時(shí),帶負(fù)電荷,用DE-52纖維素柱層析分離時(shí)被交換上,不存在于流出液中,當(dāng)換用含NaCl 的洗脫液洗脫時(shí),氯離子能將被交換上的米糠蛋白置換下來(lái),所以米糠蛋白存在于洗脫液中,收集的洗脫峰即為初步純化含有目的蛋白的樣品。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)流出液,得到3個(gè)流出峰,收集了77管,編號(hào)為1-77。然后用含0.1mol/L NaCl 的0.05mol/L

15、Tris-HCl (pH7.1的平衡緩沖液繼續(xù)洗脫,得到1個(gè)洗脫峰,收集了51管,編號(hào)78-128。接著換含0.5mol/L Na -Cl 的0.05mol/L Tris-HCl(pH7.1的平衡緩沖液繼續(xù)洗脫,得到1個(gè)洗脫峰,收集了81管,編號(hào)129-210。曲線如圖1所示。該曲線表明在收集的210個(gè)管子中8184和130131號(hào)富含大量的蛋白質(zhì)。因?yàn)橄疵摲逯械哪康牡鞍?所以將洗脫峰1中的8184號(hào)管合并,編號(hào)C 1,將洗脫峰2中的130、131號(hào)管合并,編號(hào)C 2。為了解C 1、C 2中的蛋白質(zhì)種類(lèi)及含量多少,對(duì)C 1、C 2進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。C 1、C 2二者極為相似,都有明

16、顯的3條帶,只是C 1的條帶重,C 2的條帶輕,分子量也大致相同。電泳檢測(cè)結(jié)果與曲線大致相符,洗脫峰的主峰分布在8184、130131號(hào)管處,并且主峰含有至少3類(lèi)不同的量很大的蛋白質(zhì)。為驗(yàn)證電泳結(jié)果的可靠性,測(cè)定合并后蛋白質(zhì)的OD 260、OD 280、體積,計(jì)算蛋白質(zhì)含量,結(jié)果如表7所示。表4溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響溫度/3040506070提取率/%30.7435.2843.9328.0224.90表5酶用量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響E/S/%12345提取率/%39.8043.9341.6742.8642.98表6時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響時(shí)間/h 1234蛋白質(zhì)提取率/%36.7743.934

17、5.9846.02圖1粗蛋白在纖維素DE-52陰離子交換層析柱上的初步純化32.521.510.50-0.5A 28050100150200250時(shí)間/min標(biāo)樣C 1C 235.0ku 45.0ku 26.0ku 20.0ku 14.4ku圖2粗蛋白經(jīng)纖維素DE-52陰離子交換層析收集合并的C 1、C 2樣品電泳圖流出峰1流出峰2流出峰3洗脫峰113182130818384洗脫峰2·175· 根據(jù)表7可以看出,其中C 1蛋白質(zhì)含量較多,C 2蛋白質(zhì)含量較少,與層析和電泳結(jié)果相符。2.3.2Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行再次純化將通過(guò)纖維素DE-52陰離子交換

18、層析純化后得到的C 1、C 2蛋白質(zhì)樣品合并,總體積為24.5mL ,進(jìn)一步通過(guò)SephadexG-75凝膠層析柱,利用分子排阻原理將不同分子量的蛋白分開(kāi)。經(jīng)凝膠層析后得到2個(gè)較為明顯的洗脫峰,合并3-6號(hào)管,編號(hào)為G 1、合并27、28號(hào)管,編號(hào)為G 2。結(jié)果如圖3所示。由于待純化的蛋白質(zhì)分子量較小,所以該蛋白質(zhì)洗脫時(shí)間應(yīng)較長(zhǎng),所以目的蛋白應(yīng)存在于G 2洗脫峰中。為了解G 2中的蛋白質(zhì)種類(lèi)及含量,對(duì)G 2進(jìn)行電泳檢測(cè),電泳結(jié)果如圖4所示。從圖4可看出,過(guò)柱后得到一條相對(duì)分子量約為20.0ku 的單帶,證實(shí)經(jīng)上述方法得到了一條純度較高米糠蛋白G 2。為驗(yàn)證電泳結(jié)果的可靠性,測(cè)定合并后蛋白質(zhì)的OD 260、OD 280、體積,計(jì)算蛋白質(zhì)溶液含量,結(jié)果如表8所示。3結(jié)論米糠蛋白是存在于稻米米糠中的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。通過(guò)本實(shí)驗(yàn),首先對(duì)脫脂米糠進(jìn)行酶解粗提,進(jìn)一步采用DE-52陰離子交換層析、Sephadex G-75凝膠層析兩種純化方法,對(duì)米糠蛋白結(jié)合SDS-PAGE 電泳分析,最終分離純化到一種純凈蛋白質(zhì),并且經(jīng)電泳檢測(cè)為單一蛋白條帶,相對(duì)分子量為20.0ku ,為后續(xù)純化蛋白功能與性質(zhì)研究做鋪墊。參考文獻(xiàn):1陳正行,等.米蛋白和米糠蛋白開(kāi)發(fā)利用J.糧食與油脂,2002,(4:6-92陳義勇,等.米糠和米糠蛋白的深度開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀J.