腫瘤生物治療最新進(jìn)展ppt課件

1、腫瘤生物治療最新進(jìn)展腫瘤生物治療最新進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā) 增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫； 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡； 抑制腫瘤血管的形成； 提高宿主對(duì)腫瘤常規(guī)治療的耐受力或加速損傷的恢復(fù)。腫瘤生物治療主要策略體現(xiàn)在以下幾方面：腫瘤生物治療主要策略體現(xiàn)在以下幾方面： 單克隆抗體及其偶聯(lián)技術(shù)單克隆抗體及其偶聯(lián)技術(shù) 以單抗介導(dǎo)的靶向性抗腫瘤藥物正成為腫瘤生物治療產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。1997年美國(guó)上市的利妥昔單抗（rituximab）為重組嵌合抗CD20單克隆抗體，用于治療淋巴瘤，標(biāo)志著單抗已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。 2 0 0 3 年 治 療 用 單 抗 的 銷(xiāo) 售 總 額 已 超 過(guò) 5 2 億 美 元 。 2 0

2、 0 6 年 預(yù) 計(jì) 5 0 6 0 個(gè) 治 療 性 單 抗 上 市 。 2010年預(yù)計(jì)單抗銷(xiāo)售額200億美元。 美 國(guó) 已 占 全 球 單 抗 市 場(chǎng) 9 0 % 一 支 獨(dú) 秀 。 完 全 人 源 化 單 抗 現(xiàn) 有 多 個(gè) 處 于 臨 床 前 階 段 ?？箚慰顾幬飪纱箢?lèi)抗單抗藥物兩大類(lèi)抗腫瘤單抗拮抗血管生成單抗Avastin（2004年）抗腫瘤單抗偶聯(lián)物抗生素與單抗偶聯(lián)Mylolarg（2001年）性單抗Zevalin（2002年） 內(nèi)皮因子（Endoglin）： 膜結(jié)合性糖蛋白； 分子量180KD； 腫瘤組織邊緣血管，尤其是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)。近年來(lái)單抗藥物研究具有以下特點(diǎn)：近年來(lái)

3、單抗藥物研究具有以下特點(diǎn)：第一、尋找新的分子靶點(diǎn)第一、尋找新的分子靶點(diǎn) 內(nèi)皮因子Endoglin（又稱CD105）作為生成血管內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物，正成為抑制腫瘤血管生成、治療腫瘤的重要靶分子；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：抗CD105單抗與免疫毒素連接，可使腫瘤完全消失，現(xiàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。多種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的單抗也顯示了較好的實(shí)驗(yàn)效果，如人抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）現(xiàn)已進(jìn)入了人體臨床試驗(yàn)。 目前人源化單抗的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)已較為成熟。 轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人源化單抗（1997年）； 核糖體展示技術(shù)（1999年）; 噬菌體表達(dá)系統(tǒng)； 第二、抗體的人源化第二、抗體的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠：轉(zhuǎn)基因小鼠： 滅活小鼠Ig基因；

4、 克隆并完整轉(zhuǎn)入全部或大部分人Ig基因座，并在小鼠體內(nèi)表達(dá)； 產(chǎn)生單抗具有“鼠糖基化模式”； 操作程序復(fù)雜。核糖體展示核糖體展示 (ribosome display) 核糖體展示技術(shù)的核心是利用體外核糖體表達(dá)載體構(gòu)建 sc Fv抗體庫(kù) ,并于體外轉(zhuǎn)錄為 m RNA,體外翻譯表達(dá) ,隨后以固相化的抗原分子親和篩選出核糖體 -m RNA-sc Fv復(fù)合物中的高親和力 sc Fv。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中不用任何細(xì)胞 ,是第一個(gè)完全在體外篩選有功能蛋白的方法。 該技術(shù)克服了其他一些蛋白質(zhì)篩選技術(shù) (如噬菌體展示 )需轉(zhuǎn)化細(xì)菌或真核細(xì)胞 ,因效率不高而降低庫(kù)容 ,減少抗體多樣性的局限 ,并避免了宿主隨細(xì)胞基因

5、組復(fù)制過(guò)程中可能丟失而產(chǎn)生的庫(kù)容下降 ,同時(shí)亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細(xì)胞生存而導(dǎo)致抗體丟失這一難題。由于核糖體展示技術(shù)的體外翻譯、體外篩選的特點(diǎn) ,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期 ,具有省時(shí)省力、方便快速的特點(diǎn)。v噬菌體抗體庫(kù)噬菌體抗體庫(kù)原理：采用RTPCR技術(shù)將全套人抗體重鏈V區(qū)基因克隆出來(lái)，在噬菌體表面以抗體外殼融合蛋白的形式表達(dá)分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。該技術(shù)不經(jīng)過(guò)繁雜的雜交瘤途徑，即可獲得全人源化抗體。從理論上講該抗體庫(kù)可篩選出任何一種單抗。v噬菌體抗體庫(kù)噬菌體抗體庫(kù) 與傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)相比有極大的優(yōu)越性，現(xiàn)正取代雜交瘤技術(shù)。主要特點(diǎn)： 簡(jiǎn)單易行，采用經(jīng)典的PCR分子克隆等技術(shù)，即可操作

6、； 在短期內(nèi)（數(shù)周）可篩選106108個(gè)克?。?篩選獲得的抗體庫(kù)抗體可用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，無(wú)需組織培養(yǎng)，極大降低了成本； 制備的抗體通常為Fab片段或ScFv抗體，沒(méi)有Fc段，親和力有一定影響（某些腫瘤治療性單抗親和力太強(qiáng)反而不好），但如果對(duì)某些抗體基因進(jìn)行改構(gòu)，同樣可獲得親和力強(qiáng)的抗體。第三、偶聯(lián)物分子的小型化第三、偶聯(lián)物分子的小型化 研制小型化單抗藥物對(duì)提高藥物療效有重要意義，通過(guò)酶切方法獲得的Fab片斷，其分子量相當(dāng)于完整單抗的1/3，而通過(guò)基因工程技術(shù)制備的單鏈單抗ScFv，相當(dāng)于完整單抗的1/6。例如單抗Fab片段與平陽(yáng)霉素構(gòu)成的偶聯(lián)物有顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。 近年發(fā)現(xiàn)抗腫瘤

7、抗生素Calicheamicin對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性比阿霉素強(qiáng)1000倍。Calicheamicin與單抗構(gòu)成的偶聯(lián)物對(duì)多種腫瘤有良好療效；2000年美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療免疫髓性白血病的Mylotarg就是單抗與Calicheamicin的偶聯(lián)物。第四、單抗藥物的高效化第四、單抗藥物的高效化第五、雙特異性抗體以激活宿主效應(yīng)細(xì)胞第五、雙特異性抗體以激活宿主效應(yīng)細(xì)胞 雙特異性抗體的理想目標(biāo)是當(dāng)細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞接近腫瘤細(xì)胞時(shí)增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的腫瘤殺傷功能，是改善抗體治療效果的又一發(fā)展方向。該抗體的特異性一方面是針對(duì)腫瘤細(xì)胞，另一方面是針對(duì)宿主細(xì)胞上的某些受體。理論上，使用雙特異性抗體可征募眾多效應(yīng)細(xì)胞

8、。第六、改變某些氨基酸以增加單抗的親和力第六、改變某些氨基酸以增加單抗的親和力 定向誘變可變區(qū)的特定氨基酸，可以提高抗體的親和力，這可通過(guò)分子遺傳手段結(jié)合噬菌體展示文庫(kù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。先創(chuàng)建一個(gè)突變體文庫(kù)，分離對(duì)特定抗原具有最高親和力的噬菌體。這種方法一般需耗時(shí)46個(gè)月，抗體的親和力可提高約50倍左右。當(dāng)然抗體親和力太高，抗體易聚體在腫瘤組織外周，反而影響活性。第七、抗體導(dǎo)向的酶活化前體藥物技術(shù)第七、抗體導(dǎo)向的酶活化前體藥物技術(shù) 前體藥物（Prodrug）是指該藥物無(wú)治療活性或僅有較低活性，需在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化為活性型才可顯示藥物活性；其優(yōu)點(diǎn)是可降低毒性和延長(zhǎng)藥物體內(nèi)的作用時(shí)間。在單抗治療中運(yùn)用此策略

9、是將單抗與特定的酶進(jìn)行連接，先注入單抗一酶偶聯(lián)物，間隔一定時(shí)間后再注入前體藥物，使其在靶部位活化以殺傷腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)已有單抗堿性磷酸酶偶聯(lián)物合并磷酸絲裂霉素，單抗胞嘧啶脫氨酶偶聯(lián)物合并5Fu；在臨床試驗(yàn)中取得了較好效果。 盡管美國(guó)在治療性單抗的研究方面處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；但大多數(shù)單克隆抗體藥物的靶標(biāo)沒(méi)有專利保護(hù)或者專利保護(hù)已過(guò)期。更為重要的是，單抗藥物的研發(fā)具有自己的特點(diǎn)，即眾多公司可以針對(duì)同一靶標(biāo)研究單抗藥物，它可以根據(jù)同一靶標(biāo)的不同抗體表位研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物而又不侵犯別人專利，這一點(diǎn)也會(huì)被我國(guó)SFDA認(rèn)證為新藥，因此治療性單抗在我國(guó)其有廣闊的應(yīng)用前景。v腫瘤治療性疫苗腫瘤治療性疫苗 具有良

10、好前景，目前研究主要集中在：對(duì)腫瘤免疫原的研究，包括尋找新的腫瘤特異性抗原，以及利用基因工程方法制備或改構(gòu)某些腫瘤抗原。以達(dá)到激活免疫效應(yīng)細(xì)胞。應(yīng)用細(xì)胞因子作為疫苗佐劑可明顯增加疫苗的治療效果，如：GMCSF、CD40L作佐劑，可活化CTL細(xì)胞。v腫瘤治療性疫苗腫瘤治療性疫苗樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）在腫瘤疫苗誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此用抗原改敏的DC治療腫瘤被認(rèn)為最具有發(fā)展前景?；蚬こ虂唵挝灰呙?、抗原表位的選擇是新型腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。腫瘤疫苗主要以誘導(dǎo)細(xì)胞（Ci）為主；因此T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析在疫苗設(shè)計(jì)中顯得尤為重要。v腫瘤治療性疫苗腫瘤治療性疫苗腫瘤的異質(zhì)性及腫瘤抗原的多樣性，使

11、相關(guān)抗原的特異性不高，免疫原性不強(qiáng)；用免疫缺陷的裸鼠建立的異體人類(lèi)腫瘤模型用于腫瘤藥物篩選（包括疫苗）。vDC疫苗疫苗腫瘤抗原肽或蛋白體外致敏DC 可產(chǎn)生保護(hù)性抗腫瘤T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，并引起腫瘤消退，如PSMP2肽致敏DC用于37例前列腺癌治療，30%明顯好轉(zhuǎn)。 細(xì)胞溶解物致敏DC 由于腫瘤抗原不清，采用全血細(xì)胞溶解物致敏DC，可以誘發(fā)廣泛的T細(xì)胞反應(yīng)。 此法最大的缺點(diǎn)是：細(xì)胞提取物中含有自身抗原，可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。vDC疫苗疫苗DC與腫瘤細(xì)胞融合 采用電穿孔法將DC與腫瘤細(xì)胞融合，保留了DC的生物學(xué)特征，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)該腫瘤的細(xì)胞毒性作用。 目前該方法用于個(gè)體化治療，將腫瘤病人的腫瘤細(xì)胞

12、與臍血干細(xì)胞來(lái)源的DC融合后回輸給腫瘤病人體內(nèi)，具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，臨床有效率可達(dá)70%以上。vDC疫苗疫苗細(xì)胞因子基因或腫瘤抗原基因修飾DC 如將IL18、IL12基因轉(zhuǎn)染DC，可明顯增加特異性T細(xì)胞數(shù)量。 用腫瘤相關(guān)抗原（TAA）基因修飾DC，導(dǎo)致T細(xì)胞活化，其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)效果優(yōu)于抗原肽致敏的DC疫苗。vDC疫苗疫苗DC永生化技術(shù) 目前DC回輸療法已經(jīng)試用于臨床，并取得了其它方法無(wú)可比擬的療效，在國(guó)外正用于各種腫瘤，但作為治療手段有一重要難題如何大量擴(kuò)增及保存DC。 DC永生化技術(shù): 轉(zhuǎn)染癌基因myc基因 轉(zhuǎn)染病毒基因HPV E7基因腫瘤治療性疫苗腫瘤治療性疫苗上市產(chǎn)品：黑色素疫

13、苗（Corixa公司，加拿大）。 臨床期：IMCBEC2（Imclone公司），用于肺癌。 臨床期：HER/Neu基因蛋白疫苗（ Corixa公司）， 用于乳腺癌（2003年6月）； 質(zhì)粒DNA疫苗（ Corixa公司），用于肺癌。 目前腫瘤治療性疫苗還有諸多問(wèn)題有待于解決，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：目前腫瘤治療性疫苗還有諸多問(wèn)題有待于解決，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：第一，眾多實(shí)體腫瘤缺乏特異性抗原，盡管目前已在實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)了500多種腫瘤抗原，但只有少數(shù)抗原較為特異，且這些抗原免疫原性較弱。在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)：僅激活CD8+ T細(xì)胞不足以產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫，同時(shí)需要CD4+ T細(xì)胞參與。而目

14、前的疫苗缺乏這種設(shè)計(jì)。 第二、疫苗缺乏有效的抗原遞呈?，F(xiàn)有的疫苗在此環(huán)節(jié)上存在兩個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題：一是進(jìn)入的大部分疫苗與APC不能充分接觸難以實(shí)現(xiàn)抗原遞呈；二是即使有少量疫苗被APC捕獲，也因抗原表達(dá)量甚微難以發(fā)揮有效的抗原遞呈。 第三、如何打破機(jī)體免疫耐受。腫瘤細(xì)胞通過(guò)下調(diào)Fas的表達(dá)來(lái)逃避Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。盡管目前通過(guò)采用共刺激分子修飾的疫苗有可能打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。v新的腫瘤靶基因新的腫瘤靶基因 針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的靶向治療（又稱分子靶藥物）是提高腫瘤治療效果的重要途徑。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤新靶基因被不斷發(fā)現(xiàn)。 生存素（Survivin）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)

15、的凋亡蛋白抑制因子；阻斷生存素的活化（如采用反義核酸技術(shù)），可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。v新的腫瘤靶基因新的腫瘤靶基因 2002年美國(guó)科學(xué)家在胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種大量存在于細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)（nucleostemin）及其基因，該基因位于人類(lèi)3號(hào)染色體，表達(dá)550個(gè)氨基酸；目前眾多的科學(xué)家一致認(rèn)為該基因亦是某些腫瘤治療的又一靶基因。 綜上所述，疫苗、細(xì)胞因子、腫瘤血管生成抑制劑及單克隆抗體已成為腫瘤治療的有效方法。它們均涉及到生物醫(yī)藥的重要領(lǐng)域蛋白質(zhì)表達(dá)與純化技術(shù)，這正是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵所在。 我國(guó)目前生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化最大難點(diǎn)。v蛋白表達(dá)載體蛋白表達(dá)載體 原核大腸

16、桿菌表達(dá)體系 真核a 酵母 b 哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO細(xì)胞 c 昆蟲(chóng) 大腸桿菌表達(dá)是目前最成熟的表達(dá)體系。具有操作簡(jiǎn)單、成本低產(chǎn)量高（表達(dá)量10%70%）。 缺點(diǎn)：a、大多以包涵體形式出現(xiàn)（盡管設(shè)計(jì)成分泌型） b、產(chǎn)物缺乏糖基化 c、含有大量?jī)?nèi)毒素，給純化帶來(lái)極大不方便酵母是外源基因表達(dá)最理想的真核表達(dá)體系酵母是外源基因表達(dá)最理想的真核表達(dá)體系它具有許多優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚 具有翻譯后修飾加工系統(tǒng)，如糖基化 不產(chǎn)生毒素，不含特異性的病毒 大規(guī)模發(fā)酵簡(jiǎn)單，成本低 表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，有利于純化 表達(dá)量可達(dá)菌體蛋白10%30%v蛋白質(zhì)表達(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的改構(gòu) （改變或不改變氨基酸）增加生物活性或

17、（和）減輕毒性反應(yīng)增加生物活性或（和）減輕毒性反應(yīng) 腫瘤的治療，主要是增加細(xì)胞免疫功能。 如CEA腫瘤病人體內(nèi)的CEA是抑制患者細(xì)胞免疫功能的蛋白。但如果對(duì)CEA的某些氨基酸改構(gòu)可以明顯增加活化T細(xì)胞的功能。增加生物活性或（和）減輕毒性反應(yīng)增加生物活性或（和）減輕毒性反應(yīng) 人TNF突變體較原型TNFN端缺失7個(gè)氨基酸第8位脯氨酸 精氨酸第9位脯氨酸 賴氨酸第10位脯氨酸 精氨酸 其生物學(xué)活性提高數(shù)百倍，毒性減少幾十倍。生長(zhǎng)因子受體（EGFR ）的突變株（ EGFRV ） 第27外顯子中801堿基被去除（胞外區(qū)6273位氨基酸缺失），而在融合部位新產(chǎn)生一個(gè)甘氨酸。這種缺失融合僅在使腫瘤細(xì)胞檢測(cè)到

18、EGFR 。 因此EGFRV 單抗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)僅能結(jié)合EGFR 陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，其特異性較好。改變與某些物質(zhì)的親和力改變與某些物質(zhì)的親和力 1L18是1995年發(fā)現(xiàn)的新細(xì)胞因子，在結(jié)構(gòu)和功能上與IL12相似。 1L18的前體蛋白（Pro-1L-18）為193個(gè)氨基酸，24KD。無(wú)生物學(xué)活性，成熟的1L-18為153個(gè)氨基酸，18KD，并以單體形式表現(xiàn)生物學(xué)活性，具有抗腫瘤及抗病毒活性。目前的實(shí)驗(yàn)表明，1L-18有極強(qiáng)的抗腫瘤作用，并由CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的。1L18有兩種拮抗劑有兩種拮抗劑1L18受體（1L18R） 可溶性1L18結(jié)合蛋白（ 1L18 BP） 1L18與1L18受體

19、的結(jié)合力要明顯低于其它細(xì)胞因子與受體的結(jié)合力。 1L18與1L18R結(jié)合蛋白的解離常數(shù)（KD）為18.5nmol/ L。而其它細(xì)胞因子一般為45 nmol/ L左右，1L18BP能消除1L18 消殺的生物學(xué)活性反應(yīng)， 1L18 BP這1L18 的主要拮抗劑，維持1L18 在體內(nèi)的活性水平。1L18BP 某些腫瘤組織可持續(xù)分泌查溶性1L18 BP，從而明顯降低血清中1L18 的水平。如果單純采用1L18 治療腫瘤病人， 1L18 BP含大量中和1L18 而達(dá)不到治療效果。 如果將1L18 未點(diǎn)突變（ 1L18 突變株），而維持或增加1L18 的生物學(xué)活性而這種1L18 突變體與1L18 BP的結(jié)

20、合力大為降低，即可達(dá)到“一石二鳥(niǎo)”的作用。增加在體內(nèi)的半衰期增加在體內(nèi)的半衰期 黑色素瘤相關(guān)的抗原MART1肽表位氨基酸進(jìn)行置換，該抗原刺激靶CTL活性在3h內(nèi)失活，而原抗原的半衰期僅22秒。單鏈抗體（單鏈抗體（SCFV） 是抗體可變區(qū)的重鏈和輕鏈通過(guò)連接肽（約20aa左右）相連的融合蛋白。具有： 分子量小，可迅速滲透到腫瘤內(nèi)部或其它靶組織； 避免了FC段引起的非特異性細(xì)胞毒性及負(fù)段原性； 制備工藝簡(jiǎn)單。 盡管ScFv在腫瘤生物治療中具有極其廣泛的應(yīng)用前景，但在臨床中仍存在幾個(gè)主要問(wèn)題： 缺乏Fc段，親和力大多下降 半衰期短，很快從血液清除 穩(wěn)定性不夠 ScFv基因改構(gòu)ScFv與人IgG1Fc

21、段連接成融合蛋白，改構(gòu)后ScFv半衰期延長(zhǎng)30倍，生物活性沒(méi)有下降。 在ScFv輕鏈和重鏈的可變性適當(dāng)各加入一個(gè)半胱氨酸形成以二硫鍵固定的Fc段而構(gòu)成DsFv，證實(shí)DsFv結(jié)合能力與穩(wěn)定性均優(yōu)于ScFv蛋白純化蛋白純化 不同的治療目的對(duì)不同載體表達(dá)蛋白的純度要求不一樣。 如腫瘤疫苗雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù) 方法：向水相中加入溶入水的高分子大化合物PEG等，可形成密度不同的兩相。因兩相均含有水，稱為雙水相。 輕相含某種高分子化合物 重相含鹽類(lèi)或一種化合物 體系：PEG/鹽（硫酸銨等）； PEG/葡聚糖。雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)從實(shí)用角度來(lái)講，細(xì)胞碎片分配在下相適宜。 核酸等大部分雜質(zhì)一般

22、在下相，可以同時(shí)除去 下相為無(wú)機(jī)鹽，去除成本低 蛋白質(zhì)位于上相有利保護(hù)活性（PEG保護(hù)），而下相的高濃度鹽會(huì)造成蛋白失活。 雙水相萃取技術(shù)特點(diǎn)雙水相萃取技術(shù)特點(diǎn) 清除細(xì)胞碎片的效率優(yōu)于一般的離心法和過(guò)濾法 ； 該方法關(guān)鍵是把蛋白產(chǎn)物層盡可能分在上層，而細(xì)胞碎片分在下層； 分離的純度與色譜層析還有一定的距離。因此該技術(shù)用于初步純化。高效疏水色譜（高效疏水色譜（HIC） 原理：在高離子強(qiáng)度的鹽水溶液淋洗條件下，蛋白質(zhì)的疏水部分與填料表面的疏水基團(tuán)相互作用而被吸附。淋洗液的離子強(qiáng)度降低，蛋白質(zhì)依疏水性特征依次被洗脫。即高鹽濃度吸附，低鹽濃度洗脫。HIC的特征的特征 對(duì)基質(zhì)沒(méi)有特殊要求，基質(zhì)表面具有較

23、弱的疏水基團(tuán)，孔徑在25100um 避免使用了大量有機(jī)溶劑的淋洗，有效保護(hù)了被分離物質(zhì)的生物活性。 具有“一石四鳥(niǎo)”的作用，尤其是純化大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物時(shí)具有除去變性劑（鹽酸胍）、使蛋白質(zhì)折疊（復(fù)性）去除雜蛋白，便于變性劑回收。HIC：采用高鹽時(shí)上樣、低鹽時(shí)洗脫。故大多在硫酸銨沉淀或離子交換層析后使用。洗脫條件溫和-降低鹽濃度調(diào)整溶液的pH可調(diào)整該蛋白的疏水性，因?yàn)榈鞍自诮咏入婞c(diǎn)時(shí)具有最大的疏水性。HIC疏水柱經(jīng)過(guò)再生后，通常可使用2030次；具有高蛋白質(zhì)的結(jié)合容量（10100mgml）；操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高；產(chǎn)業(yè)化程度極高，目前正廣泛用于生物制藥。高效親和液相色譜（高效親和液相色譜（HPA

24、C） 1978年，Dhlson首次報(bào)道采用HPAC分離LDH同工酶及人血清白蛋白。 特點(diǎn)：配體與分離物特異性親和力分離選擇性強(qiáng)，純化倍數(shù)優(yōu)于其它層析與其它HPLC不同，HPAC不遵循其它色譜具有的理論塔板規(guī)律HPAC柱子的專用性強(qiáng)。載體為能耐高壓的硅酸、有機(jī)聚合物目前僅HPAC常常在純化的最后一步或中間來(lái)使用以提高產(chǎn)品純度，適用于小批量樣品分析和制備，目前產(chǎn)業(yè)化有一定難度。HPAC 親和柱的制備交聯(lián)配體到介質(zhì)上 分兩步：第一步活化介質(zhì) 第二步將配體交聯(lián)到介質(zhì)上。HPAC配基配基合成基團(tuán)合成基團(tuán) 親和配基親和配基 金屬離子（Zn、Ni） 染料（三嗪類(lèi)染料）專一性差、價(jià)廉、穩(wěn)定性好。HPAC配基配基 天然基團(tuán)配基天然基團(tuán)配基化學(xué)穩(wěn)定性差化學(xué)穩(wěn)定性差 核苷酸配基（ATP） 氨基酸配基（組氨堿） 植物凝集素能可逆性結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)，由于凝集素洗脫條件溫合，易于操作，現(xiàn)應(yīng)用日漸廣泛，有較好的產(chǎn)業(yè)化趨勢(shì)。凝集素凝集素至少每個(gè)分子有兩個(gè)碳水化合物結(jié)合部位，可以用作糖蛋白的親和配基