臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢

1、臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR試劑盒的組成試劑盒的組成n核酸提取試劑n核酸擴增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴增試劑n產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動分析儀的PCR方法因其核酸擴增和檢測同時完成，故無專門的產(chǎn)物檢測試劑）臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒質(zhì)量的因素n內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學設計臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素：試劑盒質(zhì)量的因素： 擴增所需的原材料擴增所需的原材料n寡核苷酸引物和探針n緩沖液和dNTPn聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR反

2、應混合物反應混合物 Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 標 記 的 引 物 和和 或或 和和臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢寡核苷酸引物和探針寡核苷酸引物和探針n其對試劑盒質(zhì)量的影響首先是純度。其對試劑盒質(zhì)量的影響首先是純度。純度的判斷可根據(jù)260/280吸光度比值來判斷，如2.0，則需重新純化。另一種方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上的帶或遷移位置錯誤，則需重新純化。n是否有污染。是否有污染。n結合特異性（濃度）結合特異性（濃度）臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢dNTPdNTP和緩沖液和緩沖液n

3、dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的濃度n緩沖液：在儲存和擴增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須的Mg（或用于rTth的Mn）的濃度以及pH等臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNADNA聚合酶聚合酶n酶的濃度n酶的活性臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢核酸擴增方法核酸擴增方法nPCRnRTPCRn轉(zhuǎn)錄依賴的擴增（TMA）n連接酶鏈反應（LCR）n鏈替代擴增（SDA）等臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素：試劑盒質(zhì)量的因素： 核酸提取核酸提取n核酸提取的有效性n核酸提取的簡便性 臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)

4、檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素：試劑盒質(zhì)量的因素： 產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測n雜交固相n特異探針及其標記物臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒質(zhì)量的因素n內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學設計n外在因素：試劑盒的運輸和貯存外在因素：試劑盒的運輸和貯存臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢試劑盒的運輸和貯存試劑盒的運輸和貯存nPCR試劑盒的有效期一般為6個月，這是指在適當?shù)馁A存溫度下。核酸擴增部分的試劑一般要貯存于-20下；產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于28。n試劑盒從廠家

5、到用戶手中，均要經(jīng)歷運輸及運輸中的貯存，任一環(huán)節(jié)的不當，均會影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的分類試劑盒的分類n定性測定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標和Taq Man等）n定量測定： PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor熒光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的選用原則試劑盒的選用原則n參考試劑生產(chǎn)廠家的信息廣告n參考同行對有關試劑盒的使用效果n參考有關機構的綜合評價n根據(jù)使用目的n根據(jù)所在實驗室的技術特點n根據(jù)所在醫(yī)院患者的承受能力

6、臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢n外包裝：廠家名稱、檢測目的、批準文號、批號和有效期等。n內(nèi)包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢( (定性測定定性測定) )n性能質(zhì)檢性能質(zhì)檢n采用血清（樣本）盤（采用血清（樣本）盤（PanelPanel）質(zhì)檢）質(zhì)檢： PCR試劑血清（樣本）盤由一定數(shù)量的原血清陰、陽性樣本、23份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及35份系列稀釋陽性樣本所組成。樣本總數(shù)可定在20份左右。 n原血清樣本用于判斷試劑盒對特定病原體核酸原血清樣

7、本用于判斷試劑盒對特定病原體核酸檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷本用于判斷DNADNA擴增或逆轉(zhuǎn)錄及擴增或逆轉(zhuǎn)錄及DNADNA擴增的有效擴增的有效性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑的測定下性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑的測定下限。限。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢試劑特異性、靈敏度和符合率試劑特異性、靈敏度和符合率計計 算算 公公 式式臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢試劑特異性、靈敏度和符合率試劑特異性、靈敏度和符合率計計 算算 公公 式式n靈敏度（） (a / a+c)100%n特異性（） (d/b+d) 100%n符合率（） (a+d/a+b

8、+c+d) 100%臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢( (定量測定定量測定) )n樣本：已知濃度的高、中、低三種濃度質(zhì)控物。n質(zhì)檢內(nèi)容：測定的重復性 測定范圍 抗干擾能力臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢技術驗收依據(jù)：n臨床檢驗擴增檢驗實驗室管理暫行辦法 衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號n臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范 衛(wèi)檢字2002第8號臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢技術驗收內(nèi)容技術驗收內(nèi)容n實驗室設置和設備n設施和環(huán)境n人員n設備管理n檢測方法n標本管理n記錄n報告n質(zhì)量控制n抱怨 等十章共三十八條臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢實驗室設置和設備實驗室設置和設備n本章共七條。 n實驗室分區(qū)

9、：規(guī)范化分區(qū)、明確的識別標記n防污染：空氣流向、中央空調(diào)、各區(qū)間的封閉性n各區(qū)儀器設備物品配備：充分性、科學性、專用性（標識） “生物安全柜生物安全柜” “可移動紫外燈可移動紫外燈” “加樣器加樣器”臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設施和環(huán)境設施和環(huán)境n本章包括五條；n實驗室設施、工作區(qū)域、能源、照明等；n環(huán)境和實驗條件控制設施：溫濕度計溫濕度計、不間斷不間斷或穩(wěn)壓電源等或穩(wěn)壓電源等；n實驗室進出的限制和控制：人員進入控制標識、生物傳染危險性標識n實驗室“內(nèi)務管理”（如人員流動、清潔等）制度和相應設施；n廢棄血清處理、生物防護等措施和相應設施臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設施和環(huán)境需注意的問題設施和環(huán)境

10、需注意的問題n清潔程序或制度 清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔方法的具體性清潔方法的具體性n生物防護及廢棄血清處理 對工作人員工作人員的保護和對環(huán)境環(huán)境的保護 銳器銳器使用規(guī)則 生物傳染危險性廢棄物出實驗室前出實驗室前預處理臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢人人 員員n本章包括三條。n人員數(shù)量足夠；有培訓上崗證n培訓計劃：室內(nèi)的定期培訓（記錄）n人員技術（資格、培訓、技能）檔案。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設備管理（設備管理（1 1）n本章包括三條。n主要儀器設備應得到正確維護，應有設備維護程序文件；以及維護的記錄n加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等設備應有校準

11、程序文件、有明顯標識表明其校準狀態(tài)（此次校準時間及下次應校準時間）；n實驗室應保存每一臺儀器設備的檔案材料，對檔案材料的具體內(nèi)容作了詳細規(guī)定。 臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設備和質(zhì)控物（設備和質(zhì)控物（2 2）n每一臺設備的檔案內(nèi)容包括： （a）設備名稱；（b）制造商名稱、型號、序號等；（c）接收日期和啟用日期；（d）目前放置地點；（e）接收時的狀態(tài)；（f）儀器使用說明書有復印件；（g）校準和/或檢定的日期和結果及下次校準和/或檢定的日期；（h）迄今所進行的維護和今后維護計劃的細節(jié)；（i）損壞、故障、改裝或修理的歷史。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢檢檢 測測 方方 法法n本章包括三條。n標準操作程序（

12、SOP）：儀器設備操作和校準程序；標本收集處理程序；擴增檢測工作程序；儀器試劑的選購和質(zhì)檢程序；消耗性材料的購買、驗收、質(zhì)檢和貯存程序。nSOP應現(xiàn)行有效及便于使用。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢標 本 管 理n本章包括五條。n建立唯一編號識別系統(tǒng)，避免標本混淆；n標本采集、運送和保存程序；n標本接收時的狀態(tài)記錄；n標本的適用性和充分性；n標本貯存的標準操作程序及貯存溫度控制措施;n標本接收及安全處置程序；n維護實驗室誠實性的必要措施。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢記記 錄錄n本章包括三條。n有記錄管理制度：適合自身實際情況，符合現(xiàn)行規(guī)章制度；（由誰管、在何處管、保存多長時間）n原始記錄、計算和導出數(shù)據(jù)應歸檔并保存；n記錄應有有關人員的簽字；n所有記錄和報告都要妥善保管并保密。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢報報 告告n檢測結果的報告應準確、清晰和客觀；n定性測定報告“陰性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ ml報告；避免二者之間的混淆；n每份報告應包括以下信息：標題、唯一標識、檢測標本說明、標本特性和狀態(tài)、標本接收日期和檢測日期、檢測方法、檢測和校核人員簽字及發(fā)出日期、參考結果或范圍；n如對報告有效性有疑問，實驗室應立即通知臨床相關科室予以改正的程序；n有報告的發(fā)放程序：用 、 、電子郵件報告結果時的保密原則。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢質(zhì)質(zhì) 量量 控控 制制n實驗室應有室內(nèi)質(zhì)量