質(zhì)粒DNA的提取和PCR技術(shù)

1、質(zhì)粒提取w 基本原理 細(xì)菌質(zhì)粒是一類(lèi)雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份.質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，堿裂解法是最常用的方法。 基本原理為：當(dāng)菌體在當(dāng)菌體在NaOHNaOH和和SDSSDS溶液中裂解時(shí)溶液中裂解時(shí)，蛋蛋白質(zhì)與線(xiàn)性白質(zhì)與線(xiàn)性DNADNA發(fā)生變性，質(zhì)粒釋放到上清中。當(dāng)加發(fā)生變性，質(zhì)粒釋放到上清中。當(dāng)加入中和液后，因?yàn)殚]環(huán)的質(zhì)粒入中和液后，因?yàn)殚]環(huán)的質(zhì)粒DNADNA分子雖然氫鍵破壞分子雖然氫鍵破壞但雙鏈并不分離。能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心但雙鏈并不分離。能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)

2、，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNADNA變性相互纏繞成變性相互纏繞成大分子復(fù)合物而呈絮狀被大分子復(fù)合物而呈絮狀被SDSSDS覆蓋，當(dāng)加入溶液三后覆蓋，當(dāng)加入溶液三后形成形成PDSPDS被離心時(shí)可沉淀下來(lái)。被離心時(shí)可沉淀下來(lái)。試劑準(zhǔn)備 ：w 1. 溶液: 50mM葡萄糖 平衡滲透壓，調(diào)節(jié)PH值，有利懸浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 調(diào)節(jié)PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和離子 抑制DNase活性 高壓滅菌15min ，貯存于4w 2. 溶液：0.2N NaOH，1% SDS 裂解細(xì)菌，變性線(xiàn)性DNAw 3. 溶液：醋酸鉀（KAc）3M

3、，pH 4.8 中和PH值，并與SDS作用沉淀w 4.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）苯酚變性抽提蛋白，為tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚與水互溶。異戊醇的作用是降低表面張力，可以減少泡沫 w 5.異丙醇，乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）沉淀質(zhì)粒w 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/mlw 操作步驟及注意事項(xiàng)w 1挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37振蕩培養(yǎng)1418 h。-培養(yǎng)時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則細(xì)培養(yǎng)時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則細(xì)菌老化，代謝產(chǎn)物太多。影響質(zhì)粒質(zhì)量菌老化，代謝產(chǎn)物太多。影響質(zhì)粒質(zhì)量。

4、w 2取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心12000g1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。3.將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液中，劇烈振劇烈振蕩，使菌體分散混勻蕩，使菌體分散混勻。4.加200l新鮮配制的溶液，顛倒數(shù)次混勻（不要不要?jiǎng)×艺袷巹×艺袷帲?，并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解,DNA變性。-放置時(shí)間不能太長(zhǎng)。因?yàn)樵趬A性條件下放置時(shí)間不能太長(zhǎng)。因?yàn)樵趬A性條件下基因組基因組DNADNA會(huì)慢慢斷裂會(huì)慢慢斷裂 ?；靹騽?dòng)作要輕柔?；靹騽?dòng)作要輕柔,既保證細(xì)菌沉淀在試既保證細(xì)菌沉淀在試劑中充分?jǐn)U散又要避免機(jī)械剪切已變性的質(zhì)粒劑中充分?jǐn)U散又要避免機(jī)械剪切已變性的質(zhì)粒

5、DNA和染色體基和染色體基因組因組DNA 。w 5.加入150l預(yù)冷的溶液，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此時(shí)質(zhì)中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒粒DNADNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)同時(shí)K+K+使使SDS-SDS-蛋白復(fù)合物沉淀蛋白復(fù)合物沉淀。6.12000g離心10min取上清，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4離心12000g10min。-抽提掉抽提掉剩余蛋白。剩余蛋白。7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入0.50.7倍體積的異丙醇，混勻，4離心12000g，10min

6、。- -可可以用兩倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置以用兩倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置2-52-5minmin 離心。不要沉淀太離心。不要沉淀太久久8.1ml 75%乙醇洗滌沉淀1次，4離心，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。-不要太干，否則不易溶解不要太干，否則不易溶解。9.沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆?。w 10.瓊脂糖電泳檢測(cè)。檢測(cè)，定量。w 其它注意事項(xiàng)：w 1。質(zhì)粒質(zhì)量： 首先實(shí)驗(yàn)菌種生長(zhǎng)的好壞直接影響質(zhì)粒DNA的提取，因此對(duì)存放時(shí)間較長(zhǎng)的菌種需要事先加以活化。其次操作過(guò)程注意：避免基因組斷裂，除凈蛋白，鹽離子清洗干凈。 質(zhì)

7、粒數(shù)量：同量搖菌量中質(zhì)粒量取決于質(zhì)?？截悢?shù)。低拷貝數(shù)質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)添加氯霉素來(lái)增大拷貝數(shù)。w 2。陽(yáng)性菌破壁裂解比較困難，可以先用溶菌酶處理。 溶液二中NaOH不要暴露在空氣中太久?？赡軙?huì)與空氣中的CO2 與NaOH作用,減弱了其堿性。 w 3。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí) 如果能看到三條帶，這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起），注意堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中應(yīng)不含線(xiàn)性DNA ，另外如果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)得較慢的帶，可能是由于操作不慎污染的大腸桿菌基因組DNA的片斷。w 實(shí)驗(yàn)室安全：w 1。培養(yǎng)細(xì)菌的容器用過(guò)后都要及時(shí)進(jìn)行滅菌，細(xì)菌培養(yǎng)基上清不

8、要隨便丟棄，應(yīng)存放在一起進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。w 2。吸取苯酚時(shí)應(yīng)注意安全。苯酚腐蝕性很強(qiáng)。吸取氯仿 異戊醇時(shí)要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，氯仿 可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂要引起肝臟損害 。異戊醇其蒸氣或霧對(duì)眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用w 3。電泳時(shí)注意避免EB污染。 PCR技術(shù)v基本原理基本原理v反應(yīng)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)v使用步驟及注意事項(xiàng)使用步驟及注意事項(xiàng)v反應(yīng)參數(shù)要素反應(yīng)參數(shù)要素vPCR優(yōu)化優(yōu)化PCR技術(shù)w 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)

9、；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷 。-可以用于基因克隆，目的基因檢測(cè)等。w 發(fā)展：Taq DNA聚合酶：分離于溫泉菌中，耐高溫。 PCR和TaqDNA聚合酶被美國(guó)科學(xué)雜志1989年的“年度分子”，并被列為80年代10項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首w 基本原理基本原理： 類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反

10、應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。w PCRPCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) ：w PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)

11、增量可用Y(1X)n計(jì)算。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 w 反應(yīng)曲線(xiàn)：反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線(xiàn)性增長(zhǎng)期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱(chēng)平臺(tái)期數(shù)（原因：PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類(lèi)和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩兀?。w 操作步驟注意事項(xiàng)操作步驟注意事項(xiàng)：w 1。配置反應(yīng)體系。w 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：w 10擴(kuò)增緩沖液 1ul4種dNTP混合物 200umol/L引物 各110pmol模板DNA 10200ng Taq DNA聚合酶 0.25

12、uMg2+ 1.5mmol/L加雙或三蒸水至 10ulw 2。 在加熱至90以上的PCR儀中預(yù)變性94 2分鐘, 然后循環(huán): 94 1分鐘， 50 1分鐘， 72 1.5分鐘，共30輪循環(huán)。 w 3. 循環(huán)結(jié)束后, 72 10分鐘，4保存。w 4. 電泳結(jié)束，觀察w 注意問(wèn)題：w 1。防止核酸污染：PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。w 吸樣槍:吸樣槍污染值得注意.由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源。吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用 。w 開(kāi)關(guān)蓋時(shí)注意不要接觸到內(nèi)壁，并且不要開(kāi)蓋時(shí)間太長(zhǎng)

13、，以免污染。 w 2。預(yù)混和分裝PCR試劑:PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先 配制好，然后小量分裝。節(jié)省時(shí)間并保證各管成分平行 。最好在加樣時(shí)都在冰上低溫進(jìn)行，以防止加入酶后反應(yīng)立即開(kāi)始。w 3。陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的設(shè)立。陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的設(shè)立。-重要！重要！w 有利于問(wèn)題的解決，對(duì)于優(yōu)化條件以及排除污染可能性都很有有利于問(wèn)題的解決，對(duì)于優(yōu)化條件以及排除污染可能性都很有用！用！w 反應(yīng)參數(shù)要素反應(yīng)參數(shù)要素：w1。PCR反應(yīng)五要素 w （1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。保真性：rTaq-12kbp

14、,LaTaq-20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取時(shí)注意，保存在甘油中故比較粘稠。w （2）dNTP的質(zhì)量與濃度 ：在PCR反應(yīng)中，一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L 。4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。 w （3）模板；模板可以是DNA片斷，基因組，質(zhì)粒，噬菌體，菌液等任何含DNA生物樣品?？梢允菃捂湻肿?也可以是雙鏈分子,可以是線(xiàn)狀分子,也可以是環(huán)狀分子 一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 拷貝。模板純化程度影響擴(kuò)增效率。w 4）Mg2+濃度：Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著

15、的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。w （5）引物：PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5M。以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 w 引物設(shè)計(jì)的好壞是決定PCR成功與否最重要的因素。w 引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則：w 1)引物長(zhǎng)度約為18-30bp。w 2)引物中G+C含量通常為40%-60%

16、, G+C太少擴(kuò)增效果不好，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。GC含量決定引物的解鏈溫度 Tm4(G+C)+2(A+T). 3)四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)配。 4）引物3端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng), 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。w 5)在引物內(nèi), 尤其在3端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。w 6)兩引物之間尤其在3端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。 w 7)引物5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)，通常應(yīng)在5端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。w 8)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無(wú)穩(wěn)定的二級(jí)

17、結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。w 引物設(shè)計(jì)軟件： Primer5.0, 6.0w 2。PCR反應(yīng)條件的選擇：溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù) w 溫度與時(shí)間：w 變性溫度：一般9394lmin足以使模板DNA變性 。太低解鏈不完全，太高影響酶活。w 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間 ：退火溫度影響PCR特異性的。太高不能很好復(fù)性，太低會(huì)有非特異結(jié)合。提高退火溫度可以提高特異性。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。選擇合適的溫度 ：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(510)在此范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。提高退火溫度可以提高特異性。w 復(fù)性時(shí)間一般為3

18、060sec 延伸溫度與時(shí)間 ：一般選擇在7075之間，常用溫度為72。延伸速度一般1kb/min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，時(shí)間要稍長(zhǎng)些。w 循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多 vPCR優(yōu)化及特異性問(wèn)題優(yōu)化及特異性問(wèn)題1。沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶： （1）引物設(shè)計(jì)合成有無(wú)問(wèn)題。（2）模板:模板中含有雜蛋白質(zhì)，含有Taq酶抑制劑。擴(kuò)增的模板中GC含量高時(shí)或者含有重復(fù)序列時(shí)，使用GC Buffer。 （3）酶失活（4）退火溫度太高2。有目的條帶，但是很弱 ： （1）調(diào)整Mg+濃度（2）降低退火溫度-（可以考慮增加摸板量；.增加延伸時(shí)間；用產(chǎn)物做二次pcr 3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(假陽(yáng)性)原因： （1）引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多。 4。帶擴(kuò)增目的條帶都帶形模糊或者呈成片條帶。（1）引物濃度不適