去甲二氫愈創(chuàng)木酸對膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的影響

1、    去甲二氫愈創(chuàng)木酸對膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的 內(nèi)皮細胞遷移的影響        摘要目的觀察去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA）對膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的影響。方法采用微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室細胞聯(lián)合培養(yǎng)法，進行人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304細胞與人惡性膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44細胞的聯(lián)合培養(yǎng)，并以免疫組化SP方法檢測SHG-44細胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達。結(jié)果100 mol/L 的NDGA作用13 d后，SHG-44細胞V

2、EGF、bFGF 的表達明顯降低。100 mol/L NDGA對內(nèi)皮細胞的非定向運動有明顯抑制作用，對膠質(zhì)瘤細胞及其條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞定向遷移抑制顯著（P<0.01）。在50、100、150、200 mol/L 的實驗濃度范圍內(nèi)，其抑制作用呈明顯量效關(guān)系（抑制率各為12.0%，37.4%，86.7%和82.2%）。結(jié)論NDGA對內(nèi)皮細胞的非定向運動和膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的遷移均有抑制作用，并可降低瘤細胞血管生成因子的表達，提示NDGA具有抗血管生成的作用。關(guān)鍵詞去甲二氫愈創(chuàng)木酸；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；內(nèi)皮，血管；共同培養(yǎng)The effect of nordihydroguaiaretic acid

3、 on endothelial cell migration induced by glioma cellsSUN HuiqinBIAN Xiuwu CHEN YishengSHI Jingquan（Department of Pathology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China）AbstractObjectiveTo investigate the effect of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on the migration of endothelial cells

4、 (ECs) induced by glioma cells (GCs) in vitro. MethodsCells of human umbilical vein endothelial cell line ECV-304 and human malignant glioma cell line SHG-44 were co-cultured in the Falcon Cell Culture Insert system, and the effect of NDGA on the migration of ECs induced by GCs was investigated. The

5、 expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) was examined with immunohistochemistry. ResultsThe expressions of VEGF and bFGF in SHG-44 cells were reduced after treatment with 100 mol/L NDGA for 1 to 3 days. 100 mol/L NDGA significantly inhibited

6、not only the chemotactic migration of ECs induced by either glioma cells or glioma-conditioned media, but also the random motility of ECs (P<0.01). NDGA at a concentration between 50 mol/L and 200 mol/L inhibited the chemotactic migration of ECs in a dose-dependent manner (the inhibition ratios w

7、ere 12.0%，37.4%, 86.7% and 82.2%). ConclusionThe results confirm the inhibitory effects of NDGA on the migration and angiogenic factor expression of ECs, which suggests that NDGA may suppress angiogenesis of glioma.Key wordsNordihydroguaiaretic acid;Glioma;Endothelium, vascular;Coculture惡性膠質(zhì)瘤是臨床難以根治

8、的原發(fā)性腫瘤之一，血管增生活躍不僅是該瘤的病理特征，也是該瘤發(fā)展的重要原因。近年來，腫瘤血管生成的理論研究和實踐都得以迅速的深入和開展1，2。我們在應(yīng)用去甲二氫愈創(chuàng)木酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA）抗膠質(zhì)瘤研究時，發(fā)現(xiàn)它能明顯減少移植瘤及誘發(fā)瘤的血管生成。在腫瘤血管生成中，內(nèi)皮細胞向腫瘤細胞移行是實現(xiàn)腫瘤血管生成的重要環(huán)節(jié)，阻止此步的發(fā)生即能有效控制腫瘤血管生成。因此，我們就NDGA對內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的影響進行了研究。材料與方法一、細胞培養(yǎng)、膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基的制備人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304(引自美國組織培養(yǎng)庫，ATCC CRI-19

9、98)和人惡性膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44細胞（引自蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腦腫瘤研究室）。分別在含10%新生小牛血清、雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 g/ml）的M199和RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品）中常規(guī)培養(yǎng)。等量的SHG-44細胞分別在含NDGA液(終濃度為100 mol/L)和等體積PBS（pH 7.2）的含0.5%新生小牛血清的M199液10 ml中培養(yǎng)24 h，取上清，離心，0.22 m微孔濾膜過濾，分別標(biāo)記為條件培養(yǎng)基1、2（CM1,CM2），-20保存?zhèn)溆?。二、NDGA對膠質(zhì)瘤細胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)蛋白表達影

10、響的觀察經(jīng)NDGA(終濃度為100 mol/L) 或 PBS（pH 7.2）處理后13 d的SHG-44 細胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定，采用SP法（Zymed公司產(chǎn)品）進行VEGF、bFGF（PcAb,120, Santa Cruz 公司產(chǎn)品）的免疫組化染色。三、遷移實驗1微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)：雙室聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)構(gòu)見1。應(yīng)用微孔濾膜培養(yǎng)小室，進行膠質(zhì)瘤細胞與內(nèi)皮細胞的聯(lián)合培養(yǎng)，可以更接近體內(nèi)環(huán)境，模擬瘤細胞對血管內(nèi)皮細胞的作用，濾膜上8 m的微孔可允許內(nèi)皮細胞穿過到達膜的下面，這些穿越遷移的內(nèi)皮細胞可粘附于膜的下面，通過計數(shù)濾膜下面的細胞可基本反映細胞的遷移情況。1雙室聯(lián)合培養(yǎng)示意2SH

11、G-44細胞誘導(dǎo)的遷移實驗：用已長滿的SHG-44細胞消化后制成懸液，用含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其細胞濃度為1×105個/ml。對不同膠質(zhì)瘤細胞相關(guān)的試驗：分別按每孔細胞數(shù)為0、1×105個的量傳入12孔培養(yǎng)板內(nèi)，補加含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基至2 ml/孔，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)。5 h后待細胞貼壁，吸出培養(yǎng)基，以D-Hanks液洗2次，加入含0.5%新生小牛血清M199或含100 mol/L NDGA及0.5%新生小牛血清 M199液，入孵箱內(nèi)培養(yǎng)。對不同濃度NDGA相關(guān)的試驗：按每孔細胞數(shù)為1×105個的量傳入12孔培養(yǎng)

12、板內(nèi)，培養(yǎng)5 h后吸出培養(yǎng)基，以D-Hanks液洗2次，加入含0.5%新生小牛血清 M199或各含50、100、150、200 mol/L NDGA的0.5%新生小牛血清 M199液2 ml/孔，入孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每組3孔，并至少重復(fù)3次試驗。18 h后取出，裝配PET微孔濾膜培養(yǎng)小室（上室，F(xiàn)alcon Cell Culture Insert，Becton Dickinson公司產(chǎn)品）入12孔板（下室）內(nèi)，同時消化生長良好的內(nèi)皮細胞，調(diào)整其濃度為105個/ml，每個小室內(nèi)加入0.1 ml (1×104個細胞)，輕輕振蕩使之分布均勻，放入孵箱內(nèi)進行膠質(zhì)瘤-內(nèi)皮細胞的聯(lián)合培養(yǎng)。6 h后取上

13、室，以棉簽拭去小室濾膜上的內(nèi)皮細胞。PBS洗后將小室置于95%乙醇中固定10 min，PBS洗5 min 2次，蘇木素染色25min，水洗，或再加伊紅染35min，蒸餾水洗后倒置于普通顯微鏡下隨機計數(shù)（×100）13個視野內(nèi)的膜下面細胞數(shù)。同時計算細胞遷移的抑制率：細胞遷移的抑制率=（對照組遷移細胞數(shù)-NDGA組遷移細胞數(shù)）/對照組遷移細胞數(shù)×100%。3膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基引起的遷移實驗：將已制備的條件培養(yǎng)基CM1、CM2（含NDGA 100 mol/L）以1 ml、2 ml的量加入12孔培養(yǎng)板內(nèi)，補加含0.5%新生小牛血清 的 M199培養(yǎng)基，使每孔2 ml。消化內(nèi)皮細胞，

14、調(diào)其濃度為1×105個/ml，每個小室內(nèi)加入0.1 ml(1×104個細胞)，輕振蕩，入孵箱內(nèi)培養(yǎng)6 h取出，后續(xù)處理步驟，方法同上。四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用Microsoft Excel提供的統(tǒng)計程序,進行t檢驗。結(jié)果1NDGA對SHG-44細胞VEGF、bFGF蛋白表達的影響：SHG-44細胞VEGF、bFGF 蛋白表達均較強，主要定位于瘤細胞的胞質(zhì)。NDGA處理細胞13 d后，SHG-44細胞VEGF、bFGF 蛋白表達的陽性減弱, 如25。2NDGA對內(nèi)皮細胞的移行和膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的影響：傳入微孔濾膜

15、培養(yǎng)小室的內(nèi)皮細胞與在培養(yǎng)板內(nèi)相似，可很快貼壁生長。當(dāng)下室無SHG-44細胞時，移行至膜下的內(nèi)皮細胞多在10個左右。當(dāng)下室有SHG-44細胞存在時，遷移的細胞數(shù)明顯增加（6）。而經(jīng)100 mol/L NDGA處理24 h后，內(nèi)皮細胞的遷移數(shù)較對照組明顯減少（7），差異有顯著性（8，P<0.01）。當(dāng)下室有一定量的膠質(zhì)瘤細胞存在時，50、100、150和200 mol/L的NDGA處理組遷移抑制率分別為12.0%，37.4%，86.7% 和82.2%；遷移的內(nèi)皮細胞數(shù)隨NDGA濃度的增加而減少，除50 mol/L NDGA組外，與對照組比差異均有顯著性（9，P<0.05）。3NDGA

16、對膠質(zhì)瘤細胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的影響：加入條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞作用6 h后，CM1表現(xiàn)出對內(nèi)皮細胞更強的吸引作用，細胞計數(shù)顯著高于CM2組，差異有顯著性（P<0.01），說明在存在NDGA（100 mol/L）的情況下，SHG-44細胞產(chǎn)生的遷移因子減少，對內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)作用減弱，而CM含量多少之間也顯示出明顯差異，見10。2對照組48 h SHG-44細胞VEGF蛋白表達較強SP法×2003NDGA組48 h SHG-44細胞VEGF蛋白表達減弱SP法×2004對照組72 h SHG-44細胞bFGF蛋白表達強SP法×4005NDGA組72 h

17、SHG-44細胞bFGF蛋白表達減弱SP法×4006SHG-44細胞與ECV-304細胞聯(lián)合培養(yǎng)，見較多遷移至微孔濾膜()下面的內(nèi)皮細胞(EC)蘇木素染色×2007SHG-44細胞與ECV-304細胞聯(lián)合培養(yǎng)，并加入NDGA，見少數(shù)散在遷移至微孔濾膜()下面的內(nèi)皮細胞(EC)蘇木素染色×2008NDGA對內(nèi)皮細胞遷移的影響9不同濃度NDGA對內(nèi)皮細胞遷移的影響10膠質(zhì)瘤細胞條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞遷移的影響討論NDGA作為脂氧化酶的強抑制劑具有抗氧化作用。最早是將其作為添加劑用于抗食物腐敗之中，近年來發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤作用3-6，引起了許多學(xué)者的關(guān)注，但至今尚不清楚其抗腫

18、瘤機制。我們在應(yīng)用NDGA進行抗膠質(zhì)瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)其在顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞生長、誘導(dǎo)其分化的同時，也明顯抑制了移植瘤、誘發(fā)瘤內(nèi)的血管生長。近年來，腫瘤血管生成的研究已成為腫瘤研究的熱點及策略問題。腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與腫瘤誘導(dǎo)的血管生成密切相關(guān)，而通過抑制血管生成進行抗腫瘤治療，是腫瘤治療中最有前途的方法之一1，2。腦膠質(zhì)瘤能產(chǎn)生一些促血管生成的物質(zhì)，如VEGF、bFGF、aFGF、內(nèi)皮細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血小板源生長因子等。它們能通過不同機制從多種途徑刺激血管生成7，多數(shù)因子對血管內(nèi)皮細胞的增生存在作用，bFGF、VEGF 、內(nèi)皮細胞生長因子等因子還可引起內(nèi)皮細胞遷移8，而內(nèi)皮細胞的移行

19、在腫瘤血管生成中亦具有重要作用。只有通過內(nèi)皮細胞向瘤組織內(nèi)移行，才能實現(xiàn)腫瘤的血管生成，從而為迅速生長的腫瘤提供充足營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣。因此，抑制內(nèi)皮細胞向腫瘤細胞內(nèi)移行，同樣也能達到抑制腫瘤生長的目的。Yassini等9采用聯(lián)合培養(yǎng)的方法證明膠質(zhì)瘤細胞能引起內(nèi)皮、纖維母細胞的趨化移行。我們利用微孔濾膜培養(yǎng)小室，也成功地進行了膠質(zhì)瘤細胞-內(nèi)皮細胞的聯(lián)合培養(yǎng)，同時觀察了NDGA對膠質(zhì)瘤細胞及其條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的影響。我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細胞存在的情況下，可引起內(nèi)皮細胞的遷移；同樣采用膠質(zhì)瘤細胞的條件培養(yǎng)基，也可見內(nèi)皮細胞的明顯移行，說明SHG-44細胞產(chǎn)生了一些對內(nèi)皮細胞的趨化因子（包括可溶

20、性因子），從而引起內(nèi)皮細胞向膠質(zhì)瘤細胞所在區(qū)（下室）趨化移行，驗證了膠質(zhì)瘤細胞對內(nèi)皮細胞的趨化作用。Kumar等10比較了不同生長因子對血管生成不同步驟的影響，發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子對內(nèi)皮細胞的趨化作用最強，其次是bFGF、VEGF 。本研究所用的惡性膠質(zhì)瘤細胞系 SHG-44細胞有較強的血管生成因子bFGF、VEGF的表達，從而也有強的對內(nèi)皮細胞的趨化作用，所以聯(lián)合培養(yǎng)時，我們觀察到有明顯的內(nèi)皮細胞的遷移；而經(jīng) NDGA處理后bFGF、VEGF的表達降低，其趨化作用也相應(yīng)減弱。所以，在存在NDGA的情況下進行的聯(lián)合培養(yǎng)，內(nèi)皮細胞遷移數(shù)減少，并隨NDGA 含量的增加，其遷移減少也愈加明顯。究其原因

21、，一方面，是由于NDGA抑制膠質(zhì)瘤細胞的增生，瘤細胞數(shù)量減少，從整體產(chǎn)生血管生長因子量的降低所致；另一方面，也是由于NDGA抑制并減少了膠質(zhì)瘤細胞自身表達、產(chǎn)生bFGF、VEGF等因子的水平降低所致。此外，本研究結(jié)果還顯示了NDGA對內(nèi)皮細胞自身的非定向運動也有抑制作用。這一現(xiàn)象是否由于NDGA可導(dǎo)致細胞骨架的變化以致影響內(nèi)皮細胞本身的運動能力所致，尚待進一步研究。從我們既往的研究結(jié)果及本實驗來看，NDGA抗膠質(zhì)瘤的作用不僅針對瘤細胞本身，對腫瘤血管生成也具有作用，對此作進一步的研究可望為膠質(zhì)瘤的臨床治療有所幫助。(本文編輯：常秀青)基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(39570295)通信作

22、者：卞修武作者單位：孫慧勤（第三軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室，重慶400038）卞修武（第三軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室，重慶400038）陳意生（第三軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室，重慶400038）史景泉（第三軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室，重慶400038）參考文獻：1Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply. Sci Am, 1996,275:150-154.2Lund EL, Spang-Thomsen M, Skovgaard-Poulsen H, et al. Tumor angiogenesis-a new theraeutic target

23、 in gliomas. Acta Neurol Scand, 1998,97:52-62.3Wang ZY, Agarwal R, Zhou ZC, et al. Antimutagenic and antitumorigenic activities of nordihydroguaiaretic acid. Mutat Res, 1991,261:153-62.4卞修武，史景泉，辛榕, 等. 去甲二氫愈創(chuàng)木酸對人惡性膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44生長和分化的影響. 中華病理學(xué)雜志，1997，26:285-288.5McCormick DL,Spicer Am. Nordihydroguaiaretic acid suppression of rat mammary carcinogenesis induced by N-methyl-N-nitrosourea. Cancer Lett， 19