cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化與肝糖輸出調(diào)控基因表達(dá)關(guān)系的研究

1、    cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化與肝糖輸出調(diào)控基因表達(dá)關(guān)系的研究作者：王晶 劉曉民 李艷波 周立紅 馮曉紅 作者單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，黑龍江 哈爾濱 150001【摘要】 目的 觀察CREB磷酸化對(duì)肝糖輸出調(diào)控基因表達(dá)的影響。方法 利用cAMP激動(dòng)劑forskolin處理原代培養(yǎng)的大鼠肝臟細(xì)胞，以Western blot法檢測(cè)肝臟細(xì)胞處理前后CREB和磷酸化CREB蛋白的表達(dá)變化，以RTPCR方法檢測(cè)肝糖輸出調(diào)控基因PGC1、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)mRNA的表達(dá)。結(jié)果 以cAMP激

2、動(dòng)劑Forskolin作用的肝細(xì)胞CREB蛋白的磷酸化水平明顯增高，肝糖輸出調(diào)控基因PGC1、PEPCK、G6Pase mRNA的表達(dá)也增高。結(jié)論 CREB磷酸化后可以調(diào)控糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】 cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 磷酸化 肝糖輸出調(diào)控基因The relationship between cAMP response elements binding protein phosphorylation and glycogen output controlling geneWANG Jing, LIU XiaoMin, LI YanBo, et al.Department of End

3、ocrinology, the First Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang, China【Abstract】 Objective To observe the effect of cAMP response elements binding protein (CREB) phosphorylation on glycogen output controlling gene expressions.Methods The cultured primary liver cells of the r

4、ats were treated by cAMP agonist forskolin to detect the expressions of CREB before and after treatment and phosphorylated CREB protein by Western blot. The expressions of PGC1, PEPCK and G6Pase mRNA were determined by RTPCR. Results After treated by forskolin，the phosphorylated CREB protein level s

5、ignificantly increased, and the expressions of PGC1, PEPCK and G6Pase mRNA were obviously enhanced. Conclusions As the upstream regulatory factor of PGC1, the phosphorylated CREB could regulate the key enzymes expressions of gluconeogenesis.【Key words】 cAMP response elements binding protein (CREB);

6、Phosphorylation; Glycogen output controlling genecAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMPresponsive element binding protein，CREB)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛而復(fù)雜的功能。研究表明，CREB是體內(nèi)能源物質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)者,尤其在肝臟的糖代謝方面，對(duì)維持機(jī)體血糖水平的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用1，2，提示CREB可能對(duì)2型糖尿病肝糖輸出過(guò)多的發(fā)生具有重要作用。近年研究表明，糖異生途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶，PGC1水平增加可激活糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖

7、6磷酸酶(G6Pase)，造成肝糖輸出的增加，在肝臟胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用3。CREB與以上轉(zhuǎn)錄因子和糖異生關(guān)鍵酶的關(guān)系目前還不十分明確。本研究利用cAMP激動(dòng)劑forskolin處理原代培養(yǎng)的大鼠肝臟細(xì)胞，觀察CREB磷酸化對(duì)肝糖輸出調(diào)控基因表達(dá)的影響。1 材料與方法1.1 動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠，體重150200 g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，動(dòng)物合格證號(hào)20040001。1.2 方法1.2.1 試劑高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，F(xiàn)orskolin購(gòu)自MerckCalbiochem公司，膠原酶IV購(gòu)自Sigma公司，新生牛血清購(gòu)自Gi

8、bco公司，抗磷酸化CREB抗體(Ser133)、抗非磷酸化CREB抗體購(gòu)自Cell signaling technology 公司。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)引物序列(略)1.2.2 大鼠原代肝臟細(xì)胞的分離和培養(yǎng)參照文獻(xiàn)4方法。大鼠腹部消毒后，10 g/L戊巴比妥鈉麻醉(2 mg/kg，ip)，開(kāi)腹,分離肝門靜脈,經(jīng)門靜脈插管,開(kāi)放下腔靜脈,以流速10 ml/min灌流37 的前灌流液(142 mmol/L NaCl、6.7 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、pH 7.4)沖洗肝臟中的血液，再以37預(yù)熱的0.0 5

9、%IV 膠原酶灌流10 min，流速20 ml/min。當(dāng)肝包膜下肝組織呈龜背狀裂隙、膠原酶灌流液充滿肝包膜下時(shí)停止，去除肝包膜，分離肝細(xì)胞，過(guò)150目篩,以DMEM清洗細(xì)胞，50 g離心5 min，3次獲取肝細(xì)胞。沉積的肝細(xì)胞用含100 ml/L小牛血清DMEM調(diào)整密度為2.5×108/L，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活率力>85%，以此密度將細(xì)胞分別接種于25 ml培養(yǎng)瓶和6孔板。在DMEM (10% cuff serum)、37、20%O2、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)2.5 h后，將細(xì)胞清洗一次。之后，再在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)21.5 h(合計(jì)24 h)，用得到的第一代培養(yǎng)肝細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)

10、。1.2.3 藥物干預(yù)試驗(yàn)原代肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用含0.3%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化，再更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，以10 mmol/L(終濃度)的cAMP激動(dòng)劑Forskolin作用細(xì)胞(作用1 h用于Western blot，作用4 h用于RTPCR)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)以Western blot法檢測(cè)肝臟細(xì)胞處理前后CREB和磷酸化CREB蛋白的表達(dá)變化，以GAPDH為內(nèi)參。以RTPCR方法檢測(cè)肝糖輸出調(diào)控基因PGC1、PEPCK、G6Pase mRNA的表達(dá)，具體方法參考文獻(xiàn)5，6。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，以x

11、7;s表示，運(yùn)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 Forskolin處理前后原代肝細(xì)胞CREB、pCREB蛋白的表達(dá)見(jiàn)表2。以cAMP激動(dòng)劑Forskolin作用的肝細(xì)胞，與對(duì)照組相比，CREB蛋白的磷酸化水平明顯增高(P<0.01),而CREB的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2 Forskolin處理前后原代肝細(xì)胞CREB、pCREB蛋白的表達(dá)(略)2.2 Forskolin處理前后原代肝細(xì)胞PGC1、PEPCK和G6Pase mRNA的表達(dá)見(jiàn)表3。以cAMP激動(dòng)劑Forskolin作用的肝細(xì)胞，與對(duì)照組相比，肝糖輸出調(diào)控基因PGC1、PEPCK、G6Pas

12、e mRNA的表達(dá)也增高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表3 處理前后原代肝細(xì)胞PGC1、PEPCK和G6Pase mRNA的表達(dá)(略)3 討 論磷酸化與脫磷酸化是調(diào)節(jié)CREB活性的重要機(jī)制之一，目前研究最多的是PKA，在PKA介導(dǎo)下，通過(guò)CREB在Ser133位點(diǎn)的磷酸化形成磷酸化CREB和磷酸化ATF1(activating transcription factor 1)，cAMP調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)。近幾年的研究顯示，空腹?fàn)顟B(tài)下CREB通過(guò)抑制PPAR和誘導(dǎo)PGC1(PPAR Gamma Coactivator)而調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝7。糖異生的速率主要靠某些糖異生途徑單向酶(關(guān)

13、鍵酶)的激活來(lái)控制，如PEPCK、果糖1,6雙磷酸酶及G6Pase，編碼這些蛋白的基因在轉(zhuǎn)錄水平上被一些關(guān)鍵激素控制，特別是胰島素、胰高血糖素和糖皮質(zhì)激素。無(wú)論是在1型糖尿病還是2型糖尿病，肝糖輸出過(guò)多是空腹高血糖和餐后高血糖的重要原因8。Herzig等1研究揭示了空腹?fàn)顟B(tài)下CREB激活生糖基因的兩步模式：空腹早期，針對(duì)兒茶酚胺和胰升糖素的刺激，CREB Ser133磷酸化，通過(guò)CREB介導(dǎo)的直接效應(yīng)而誘導(dǎo)某些生糖基因(如PEPCK)的表達(dá);若繼續(xù)空腹，CREB通過(guò)誘導(dǎo)肝臟PGC1的表達(dá)進(jìn)一步強(qiáng)化生糖基因(PEPCK、丙酮酸羧化酶和G6Pase)的表達(dá)，隨后PGC1對(duì)糖皮質(zhì)激素信號(hào)做出反應(yīng)，介

14、導(dǎo)糖異生過(guò)程的激活。本研究中根據(jù)文獻(xiàn)9及預(yù)實(shí)驗(yàn)，加入cAMP激動(dòng)劑Forskolin作用于原代培養(yǎng)的大鼠肝臟細(xì)胞，可使CREB的磷酸化水平明顯增高，而且PGC1、PEPCK和G6Pase mRNA的表達(dá)也明顯高于對(duì)照組，可見(jiàn)CREB是PGC1的上游調(diào)節(jié)因子，其正常的生理作用對(duì)維持機(jī)體血糖穩(wěn)定具有重要意義，提示磷酸化CREBPGC1糖異生關(guān)鍵酶這一反應(yīng)鏈在2型糖尿病的病理生理改變中發(fā)揮一定的作用，阻斷它們之間作用的小分子化合物有可能作為降低2型糖尿病空腹血糖的有效輔助治療手段?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Herzig S，Long F，Jhala US,et al.CREB regulates Hepati

15、c Gluconeogenesis via the Coactivator PGC1J.Nature,2001;413:17983.2 Herzig S，Hedrick S，Morantte L,et al.CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPARgammaJ.Nature，2003;426:1903.3 Handschin C，Spiegelman BM.Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator 1 co

16、activators，energy homeostasis，and metabolismJ. Endocr Rev，2006;27(7):72835.4 趙 媚,肖 琳,楊 琳，等.丙戊酸鈉對(duì)培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的毒性作用J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005;26(3)：22931.5 Oetjen E，Lechleiter A，Blume R，et al.Inhibition of membrane depolarisationinduced transcriptional activity of cyclic AMP response element binding protein (CREB) by the dualleucinezipperbearing kinase in a pancreatic islet beta cell lineJ.Diabetologia，2006;49(2):33242.6 趙文惠，蕭建中，楊文英，等.肝臟胰島素抵抗與肝糖輸出調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)系J.中華肝臟病雜志，2006;14：457.7 Gonzalez GA,Yamamoto KK,Fischer WH,et al.A cluster of