凍干鯉魚粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留測定的兩種前處理方法比較

1、227分析檢測食品科學2011, Vol. 32, No. 02凍干鯉魚粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留測定的兩種前處理方法比較趙 艷1，王麗敏1，劉耀敏1，張鳳枰1,2,3, *(1.通威股份有限公司，四川 成都 610041；2. 中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；3. 中國科學院研究生院，北京 100049摘要：采用固相萃取和液液萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS，對凍干鯉魚粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量進行測定，比較兩種前處理方法的測定結(jié)果。固相萃取法：樣品經(jīng)EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取，HLB 固相萃取柱凈化，氮氣濃縮；液液萃取法：樣

2、品經(jīng)酸性乙腈溶液提取，正己烷液液萃取凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。兩種方法的提取液濃縮定容后，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標法定量。固相萃取和液液萃取法的回收率分別為95%112%和75%90%，RSD 分別為2.9%7.4%和1.0%4.6%，檢出限分別為1.0g/kg和0.10.2g/kg。結(jié)果表明，兩種方法簡便快速、重現(xiàn)性好、選擇性強，均適用于魚肉和凍干鯉魚粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留的測定。關鍵詞：恩諾沙星；環(huán)丙沙星；殘留；凍干鯉魚粉；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MSComparison of Two Pretreatment Methods for UPLC-MS/MS

3、Determination of Enrofloxacin andCiprofloxacin Residues in Freeze-dried Carp MealZHAO Yan1，WANG Li-min1，LIU Yao-min1，ZHANG Feng-ping1,2,3, *(1. Tongwei Co. Ltd., Chengdu 610041, China；2. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences,Xining 810001, China；3. Graduate University o

4、f Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, ChinaAbstract ：Sample pretreatment was achieved by two different methods, solid-phase extraction and liquid-liquid extraction,before the analysis of enrofloxacin and ciprofloxacin residues in freeze-dried carp meal on UPLC-MS/MS. The analytical resultsw

5、ere compared to examine if the two pretreatment methods influence the accuracy of determination. The solid-phase extractionprocedure was composed of extraction with EDTA-Mcllvaine buffer, clean-up on HLB column and blowing to dryness undernitrogen gas. Liquid-liquid extraction pretreatment was achie

6、ved sequentially through extraction with acidified acetonitrilefollowed by clean-up by liquid-liquid extraction with n-hexane and evaporation to dryness in a rotary evaporator. Both residueswere dissolved in 1 mL of mixed solution of acetonirile and 0.2% formic acid (1:9, V/V prior to injection into

7、 UPLC-MS/MSsystem. For the quantitation of enrofloxacin and ciprofloxacin, external standard method was used. Average spike recoveries ofsolid-phase extraction and liquid-liquid extraction ranged from 95% to 112% and from 75% to 90%, with relative standarddeviations between 2.9% and 7.4% and between

8、 1.0% and 4.6%, respectively (n = 6. The limits of detection (LOD of solid-phase extraction for the two analytes were both 1.0g/kg, and the LOD of liquid-liquid extraction was 0.1g/kg for enrofloxacinand 0.2g/kg for ciprofloxacin. As a conclusion, both methods are characterized by simplicity, rapidi

9、ty, good reproducibility and highselectivity, and therefore can be used to determine enrofloxacin and ciprofloxacin residues in fish meat and freeze-dried carp meal.Key words：enrofloxacin ；ciprofloxacin ；residues ；freeze-dried carp meal；UPLC-MS/MS中圖分類號：TS207.3 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(201102-0227-04收稿

10、日期：2010-03-01作者簡介：趙艷(1983 ，女，工程師，碩士，研究方向為食品質(zhì)量安全檢測。E-mail ：zhao518yan* ：恩諾沙星和環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類(qui no lo n es ，QNs 藥物，由于其抗菌作用強、抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強，而且價格低廉，已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的抗感染藥物1。但是，動物用藥后2011, Vol. 32, No. 02食品科學分析檢測228的藥物殘留可以通過食物鏈傳遞，會引起人體不良反應，影響人體健康。因此，對動物體內(nèi)喹諾酮類藥物殘留量的檢測已越來越受到人們的關注。目前常見的喹諾酮殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法2-3、高效毛

11、細管電泳法4、液相色譜法5-8和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法9-14。本實驗采用固相萃取和液液萃取兩種方法對樣品進行前處理，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，比較了兩種前處理方法的測定結(jié)果和優(yōu)缺點，為水產(chǎn)品及其制品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測提供參考。1材料與方法1.1材料、試劑與儀器鯉魚 鮮魚2000g ，放血、去鱗、去內(nèi)臟、去皮，取背部肌肉攪碎；凍干鯉魚粉 威海出入境檢驗檢疫局。乙腈、甲醇、正己烷、甲酸(均為色譜純 美國Fis h er 公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉(均為分析純 國藥集團化學試劑公司；環(huán)丙沙星(純度94.0%、恩諾沙星(純度99.0% 德國Dr Ehrenstofer公

12、司；水為Milli-Q 超純水；Oasis HLB 6mL/200mg固相萃取小柱 美國Waters 公司。AcQuity TM -TQD 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters 公司；MTN-2800氮吹儀 天津奧特賽恩斯公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Buchi公司；KQ5200B 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64 R離心機 Beckman Coulter公司；CP224S 電子分析天平 Sar-to riu s 公司。1.2標準溶液和提取溶液的配制分別準確稱取適量恩諾沙星和環(huán)丙沙星標準品，用乙腈溶液配制成0.2mg/mL的標準儲備液，18避光保存。Mcllv

13、aine 緩沖溶液：將1000mL 0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，必要時用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至4.00±0.05；EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液：稱取60.5g 乙二胺四乙酸二鈉放入1625mL Mcllvaine 緩沖溶液中，振搖使其溶解。1.3實驗條件1.3.1液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm ，1.7m ；流速：0.2mL/min；柱溫：35；進樣體積：10L 。流動相：A 為甲醇-乙腈溶液40:60(V/V ，B 為體積分數(shù)為0.2%甲酸溶

14、液；梯度洗脫條件見表1。時間/min0681012甲醇-乙腈溶液/%10309090100.2%甲酸溶液/%9070101090表1 梯度洗脫條件Table 1 UPLC gradient elution conditions1.3.2串聯(lián)質(zhì)譜條件電離模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+ ；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM ；毛細管電壓：1. 2k V ；透鏡電壓：0. 1V ；離子源溫度：120；脫溶劑氣溫度：350；脫溶劑氣流量：650L/h 。定性離子對、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量見表2?；衔锬鸽x子(m/z 子離子(m/z 錐孔電壓/V碰撞能量/eV環(huán)丙沙星332.10288.1*45

15、18314.04522恩諾沙星360.04316.1*4520245.14526表2恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Qualitative and quantitative ions, cone voltage and collisionenergy for enrofloxacin and ciprofloxacin in MS/MS analysis注：*. 定量離子。1.4固相萃取法1.4.1提取稱取試樣0.5g(精確至0.1mg ，置于50mL 聚四氟乙烯離心管中，加入2.5g 水，搖勻，靜置10min ，然后加入20mL 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖

16、溶液，用均質(zhì)器均質(zhì)1min ，超聲提取10min ，5條件下10000r/min離心5mi n 。1.4.2凈化分別用6mL 甲醇洗滌、6mL 水活化HLB 固相萃取柱，取4mL 提取液以23mL/min的速度過柱，棄去濾液，用2mL 5%甲醇溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，再用6m L 甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮氣吹干后，用1mL 乙腈-體積分數(shù)0.2%甲酸溶液(體積比1:9溶解，渦旋混合1min ，0.22m 濾膜過濾，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。1.4.3基質(zhì)加標標準工作曲線的制備移取一定體積的標準儲備液，用初始流動相稀釋成1.0g/mL質(zhì)量濃度的混合標準溶液。取陰性樣品5

17、份，依次加入一定量的混合標準溶液，按照以上方法處理，得到質(zhì)量濃度分別為2、5、10、30、60ng/mL的系列標準溶液。1.5液液萃取法1.5.1提取稱取試樣0.5g(精確至0.1mg ，置于50mL 聚四氟乙烯離心管中，加入2.5g 水，搖勻，靜置10min ，然后加入20mL 2%的甲酸-乙腈溶液，用均質(zhì)器均質(zhì)1min ，超聲提取10min ，4000r/min離心5min 。1.5.2凈化將上清液轉(zhuǎn)移到預先加有25mL 乙腈飽和的正己烷的分液漏斗中，充分振蕩、靜止分層，棄去上層溶液，OROR229分析檢測食品科學2011, Vol. 32, No. 02將下層溶液取4mL 轉(zhuǎn)移至50mL

18、 雞心瓶中，于40水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干。用1mL 乙腈-體積分數(shù)0.2%甲酸溶液(體積比1:9溶解，渦旋混合1min ，0.22m 濾膜過濾后，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。1.5.3標準工作曲線的制備移取一定體積的標準儲備液，用初始流動相稀釋成 質(zhì)量濃度1.0g/mL的混合標準溶液，將混合標準溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、10、30、60ng/mL的標準溶液。2結(jié)果與分析2.1兩種前處理方法的優(yōu)化 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在多數(shù)溶劑(包括水 中溶解性較差，而易溶于含水相(質(zhì)子化或酸解離 的酸性溶液，因此兩種提取方法中的提取液均為酸性溶液。 實驗發(fā)現(xiàn)，固相萃取法中用緩沖液提取時容易乳化，造成離心不

19、完全，上柱時柱子容易堵塞。比較用4、l0、20mL 提取液上柱濃縮，發(fā)現(xiàn)4mL 提取液上柱，處理時間短，且回收率理想，最終確定用4m L 提取液進行過柱。液液萃取法中用組織滲透力強的乙腈并在其中添加2%甲酸作為提取溶劑進行提取實驗，結(jié)果表明，該提取試劑不僅除蛋白的效果好，而且容易濃縮。然而將20mL 提取液全部用來濃縮，回收率僅50%，且雜質(zhì)干擾嚴重。實驗比較了用4、l0、20mL 提取液進行濃縮，發(fā)現(xiàn)4m L 提取液濃縮效果最佳，回收率均大于70%，最終確定用4mL 提取液進行濃縮。2.2流動相的選擇環(huán)丙沙星、恩諾沙星結(jié)構(gòu)式中含有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，因而流動相的pH 值可能會對

20、靈敏度造成一定的影響，在流動相中加入甲酸，可以有效改善峰形，增加其離子化效率。實驗證明，0.2%的甲酸-乙腈溶液比0.1%的甲酸-乙腈作流動相檢測靈敏度高，且峰形較佳。然而當pH 值過低時，會對色譜系統(tǒng)的壽命有影響。故本研究以0.2%的甲酸-乙腈溶液為流動相，采用梯度洗脫的方法，可獲得較好的實驗結(jié)果(圖1 。圖1加標魚肉樣品的離子色譜圖(加標量10g/kgFig.1 Ion chromatograms of fish meat spiked with standards(at 10g/kg方法化合物線性范圍/(g/L回歸方程相關系數(shù)檢出限/(g/kg定量限/(g/kg固相萃取法恩諾沙星260Y

21、 =461.4470X 213.38600.99921.03.0環(huán)丙沙星260Y =227.7990X 40.59720.99941.03.0液液萃取法恩諾沙星0.560Y =360.4120X +73.90760.99900.10.3環(huán)丙沙星0.560Y =263.0780X 8.54030.99960.20.7表3恩諾沙星和環(huán)丙沙星的回歸方程、檢出限(LOD和定量限(LOQTable 3 Linear regression equations and limits of detection and quantification of enrofloxacin and ciprofloxac

22、in化合物 固相萃取法液液萃取法檢測結(jié)果/(g/kg回收率/%回收率校正結(jié)果/(g/kgZ 值檢測結(jié)果/(g/kg回收率/%回收率校正結(jié)果/(g/kgZ 值恩諾沙星448104.04311.5540184.44750.43環(huán)丙沙星99.1100.598.61.1578.779.399.21.11表5恩諾沙星和環(huán)丙沙星在凍干鯉魚粉中的檢測結(jié)果Table 5 Contents of enrofloxacin and ciprofloxacin in freeze-dried carp meal determined based on two different sample pretreatmen

23、t methods100505.83相對豐度/%510環(huán)丙沙星m/z 332.1m/z 288.15.21×1041.511.765.83相對豐度/%510環(huán)丙沙星m/z 332.1m/z 3142.11×104100506.34相對豐度/%510恩諾沙星m/z 360.04m/z 245.14.85×104100506.33相對豐度/%510恩諾沙星m/z 360.04m/z 316.19.26×104100502011, Vol. 32, No. 02食品科學分析檢測230化合物添加量/(g/kg固相萃取法 液液萃取法回收率/%RSD/%回收率/%R

24、SD/%4112.17.486.74.6恩諾沙星10103.73.887.02.82095.44.579.61.94109.16.489.73.1環(huán)丙沙星1096.52.975.81.12095.83.272.61.0表4空白樣品加標回收率和測定的相對標準偏差(n =6Table 4 Recoveries and relative standard deviations for enrofloxacinand ciprofloxacin blank samples spiked with standards (n =62.3方法線性范圍、檢出限和定量限分別以恩諾沙星和環(huán)丙沙星的響應面積為縱坐標

25、、以質(zhì)量濃度為橫坐標，進行線性回歸，以3倍信噪比計算檢出限(LOD，以10倍信噪比計算定量限(LOQ。線性方程、檢出限和定量限見表3。固相萃取和液液萃取檢出限分別為1.0g/kg和0.10.2g/kg。2.4回收率與精密度比較以陰性鯉魚背部肌肉為代表，按照上述兩種處理方法分別進行樣品分別添加4、10、20g/kg 3個水平的添加回收試驗，每個水平下做6次平行實驗，結(jié)果見表4。3結(jié)論本實驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定凍干鯉魚粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留，通過對固相萃取和液液萃取兩種方法的方法學考察和樣品測定結(jié)果進行比較，表明這兩種方法的提取效率不存在顯著差異，但兩種方法在耗費時間、溶劑使用量

26、和所需設備的成本方面存在較大的差異；固相萃取法的回收率高、液液萃取法的檢出限低，但樣品測定結(jié)果用添加回收校正后均能得到滿意的結(jié)果，兩種前處理方法都可以滿足水產(chǎn)品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測要求，分析人員可以根據(jù)具體的實驗條件選用不同的處理方法。參考文獻：1李俊鎖, 邱月明, 王超, 等. 獸藥殘留分析M. 上海: 上?？茖W技術出版社, 2002: 228-264.2鄭晶, 黃曉蓉, 鄭俊超, 等. 微生物抑制法與酶聯(lián)免疫法檢測鰻魚中喹諾酮類藥物殘留的比較研究J. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2006, 16(1:79-81.3劉曉紅, 王殿夫. 鯉魚中恩諾/環(huán)丙沙星殘留量的酶聯(lián)免疫檢測J.食品科學, 2

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