反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中單硝酸異山梨酯的濃度

1、論 著反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中單硝酸異山梨酯的濃度倪 淵摘要 目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中單硝酸異山梨酯濃度。方法 采用Ultrasphere C 18柱(46mm ×250mm , 以甲醇-正己烷-乙腈(9064 為流動(dòng)相, pH 74, 紫外220nm 檢測(cè), 按內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)曲線在251600g /L 范圍內(nèi)有良好線性, 最低檢測(cè)濃度為10g/L, 方法回收率為970%1021%, 日內(nèi)精密度為150%310%, 日間精密度為361%427%。結(jié)論 反相高效液相色譜法方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確, 可用于復(fù)方單硝酸異山梨酯緩釋制劑生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定,

2、 為臨床合理用藥提供依據(jù)。關(guān)鍵詞 單硝酸異山梨酯; 反相高效液相色譜法; 血藥濃度中圖分類號(hào) R446 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1726-7587(2006 22-2023-02Reverse phase H PL C for deter mination of isosor bide mononitrate in human plasmaNI Y uan. Nanhua University, Hengya ng 421002, ChinaAbstra ct O bjective This paper reported a reverse phase HPLC for determinat

3、ion of isosorbide mononitrate in human plasma. Methods Using an Ultrasphere C 18column (4. 6mm ×250mm and mobile phase of metha nol, n hexane and acetonitrile (9064 (pH 74 with UV detector at 220nm quantified by internal standard method. Results The standard curve had a good linear in the range

4、 of 251600g/L with the minimum detec tion of 10g /L.The recovery was 970%1021%.The within day and day to day RSD ranged from 150%310%and 361%427%.Conclusion This method provides a simple, sensitive and accurate way in the use of detection of bioavailability and pharmacodynamic parameters of compound

5、 isosorbide mononitrate sus tained release tablets with good results.K ey words isosorbide mononitrate; RP HPLC; serum drug level單硝酸異山梨酯(isosorbide mononitrate, ISM N 為硝酸異山梨酯的主要活性代謝產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)擴(kuò)張外周血管, 特別是增加靜脈血容量, 減少回心血量, 降低心臟前后負(fù)荷, 從而減少心肌耗氧量; 同時(shí)還可以促進(jìn)心肌血流重新分布, 改善缺血區(qū)血流供應(yīng), 單硝酸異山梨酯可能通過(guò)這兩方面發(fā)揮抗心肌缺血作用。目前國(guó)內(nèi)復(fù)方單硝酸異山

6、梨酯緩釋片上市不久, 為考察其相對(duì)生物利用度及了解藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), 本文建立了測(cè)定血漿中單硝酸異山梨酯的反相高效液相色譜法。有關(guān)血中單硝酸異山梨酯的測(cè)定, 文獻(xiàn)報(bào)道有氣相色譜-電子捕獲法13, 高效液相色譜法46, 而反相高效液相色譜法報(bào)道少見。本研究建立簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的RP -HPLC 法, 可廣泛用于復(fù)方單硝酸異山梨酯緩釋制劑生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定以及治療藥物監(jiān)測(cè)。1 儀器與試藥11儀器Agilent -1100高效液相色譜分析儀, 配備G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器和G1315BDAD 檢測(cè)器, Agilent 色譜工作站。12 色譜條件 色譜柱:預(yù)柱Ultrasphere C 18柱

7、(5m, 46mm ×45mm , 分析柱Ultrasphere C 18柱(5m, 46mm ×250mm ; 流動(dòng)相:甲醇-正己烷-乙腈(9064, pH =74 , 流速10mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)220nm, 靈敏度為001AUFS 。13 藥品與試劑 單硝酸異山梨酯(河南天方藥業(yè)有限作者單位:421002湖南衡陽(yáng), 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院藥劑科公司 ; 卡馬西平(中國(guó)藥品生物制品檢定所 。乙腈、正己烷為色譜純, 甲醇為分析純。14 標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取單硝酸異山梨酯100mg 及卡馬西平100mg, 分別置于2個(gè)50ml 容量瓶中, 加乙腈溶解并定容至刻度即成單硝酸異

8、山梨酯和內(nèi)標(biāo)卡馬西平貯備液(200mg/L , -20保存可穩(wěn)定2個(gè)月, 臨用時(shí)將貯備液用重蒸水稀釋至所需濃度, 即得單硝酸異山梨酯系列工作液(8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125g /L和內(nèi)標(biāo)稀釋液(126g/L 。2 方法與結(jié)果21 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取正常人空白血漿各05ml 共7份, 分別加入單硝酸異山梨酯標(biāo)準(zhǔn)系列工作液100l, 使各管血漿濃度分別為1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25g/L, 再分別加入內(nèi)標(biāo)稀釋液100l, 025mol /L 氫氧化鈉溶液100l, 混勻后用乙醚50ml 渦旋混合萃取3min, 離心(250

9、0r /min 10min, 小心將有機(jī)相4ml 移至另一尖底離心管內(nèi), 置于40水浴中氮?dú)獯蹈? 殘?jiān)苡?00l 流動(dòng)相, 取20l 進(jìn)樣。由單硝酸異山梨酯與卡馬西平的峰面積比(Y 對(duì)單硝酸異山梨酯濃度(X 作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算得回歸方程為:Y =02297+05586X(r =0999, n =7 , 表明在血藥濃度251600g/L 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。22 樣品測(cè)定 取受試者血漿樣品05ml, 加入重蒸水100l, 按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作, 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出各樣品中單硝酸異山梨酯濃度。23 保留時(shí)間及檢測(cè)限 空白及樣品血漿色譜圖(見圖1 中單硝酸異山梨酯及內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間分別為

10、68min 和84min(分離度為20 。單硝酸異山梨酯的最低檢出量為2ng, 最低檢出濃度為10g/L(以信噪比3計(jì) 。24 方法精密度 取含單硝酸異山梨酯高、中、低3種濃度的樣品, 于同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次, 精密度分別為15%、206%、310%; 4日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次, 精密度分別為361%、398%、427%。25 方法回收率 取空白血漿3份, 配成含單硝酸異山梨酯高、中、低3種濃度的樣品, 每個(gè)濃度樣品分成5份按前述樣品測(cè)定法測(cè)定, 計(jì)算方法回收率分別為970%、981%、102 1%。. 空白 . 正常人口服復(fù)方單硝酸異山梨酯緩釋片(含60mg 單硝酸異山梨酯 后5hA. 內(nèi)標(biāo)卡馬西平

11、 B. 單硝酸異山梨酯圖1 色譜圖3 討論31 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 單硝酸異山梨酯無(wú)明顯紫外吸收峰, 僅在近紫外區(qū)有吸收(見圖2 , 為提高檢測(cè)靈敏度, 檢測(cè)波長(zhǎng)應(yīng)越短越好, 但由于流動(dòng)相在近紫外區(qū)吸收明顯增高, 綜合二者因素, 本文采用220nm 測(cè)定既不使流動(dòng)相本底吸收太高(本底吸收值050 , 又能達(dá)到測(cè)定血漿中單硝酸異山 梨酯靈敏度要求。40mg /L 甲醇-水(14 溶液圖2 單硝酸異山梨酯紫外吸收曲線32 萃取條件選擇 按趙弈等報(bào)道3, 在pH 70緩沖液存在下用乙酸乙酯提取, 紫外檢測(cè)雜質(zhì)峰較多。本文用乙醚提取, 回收率與乙酸乙酯相當(dāng), 但雜質(zhì)峰較少, 且在堿性條件下提取比中性條件下雜

12、質(zhì)峰更少。本文建立的測(cè)定血漿中單硝酸異山梨酯的反相高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn), 能滿足藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究的需要, 已用于復(fù)方單硝酸異山梨酯緩釋片的生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定以及治療藥物監(jiān)測(cè)(待發(fā)表 , 結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 為單硝酸異山梨酯人血漿中濃度測(cè)定提供了一種新的選擇。參考文獻(xiàn)1 劉會(huì)臣. 中國(guó)人口服5-單硝酸異山梨酯緩釋片的藥動(dòng)學(xué)和不良反應(yīng)探討. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2000, 20(7 :416.2 夏桂珠. 毛細(xì)管氣相色譜-電子捕獲法測(cè)定人血清中5-單硝酸異山梨醇酯的濃度和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù). 藥學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 29(8 :634.3 趙奕. 5-單硝酸異山梨醇酯片在人體的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度的研究. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 1995, 11(1 :33.4 Agbaba D. High performance liquid chromatographic assay for isosor bide 5-mononitrate and impurities of inorganic nit rates in pha