核素標(biāo)記化合物

1、第四章核素標(biāo)記化合物第一節(jié) 概述一、標(biāo)記化合物的概念凡是分子中某一原子或某些原子（或基團(tuán)）被放射性核素或穩(wěn)定核素所取代，而成為一類易被識(shí)別的化合物， 則稱之為核素標(biāo)記化合物314（以下簡(jiǎn)稱標(biāo)記化合物） 。如 CH · COOH是放射性14313COOH則是穩(wěn)定核素131413C的標(biāo)記化合物； CH·C 的標(biāo)記化合物。其中C 和C 均為標(biāo)記原子。本章側(cè)重介紹放射性標(biāo)記化合物（radionuclide labeled compound）, 僅在第三節(jié)中對(duì)穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物和其他標(biāo)記化合物作扼要說(shuō)明。二、常用的術(shù)語(yǔ)及標(biāo)記化合物的命名( 一 )標(biāo)記化合物的分類按照取代原子與被取代原

2、子的關(guān)系，可把放射性標(biāo)記化合物分為兩類：1同位素標(biāo)記化合物（isotopic labeled compound）化合物中某元素的穩(wěn)定同位素原子被同一元素的放射性同位素或穩(wěn)定同位素原子取代，稱為同位素標(biāo)記化合物，取代前后的化合物，在理化性質(zhì)上完全相同（同位素效應(yīng)除外），這類標(biāo)記稱為同位素標(biāo)記（isotopiclabeling）。如葡萄糖分子中的C、H 分別被 14C、3H取代，二氧化碳中的碳被14C 或 13 C取代，都得到同位素標(biāo)記化合物。2.非同位素標(biāo)記化合物（nonisotopic labeled compound）該類標(biāo)記化合物是用化學(xué)性質(zhì)相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某

3、元素的穩(wěn)定核素原子,這種標(biāo)記稱非同位素標(biāo)記（nonisotopic labeling）。此類標(biāo)記化合物即非同位素標(biāo)記化合物，如125I-IgG （免疫球蛋白） 。非同位素標(biāo)記亦稱非理想標(biāo)記，得到的標(biāo)記化合物在理化和生化性能上與原化合物有一定的差異，但嚴(yán)格控制質(zhì)量，仍能在醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。標(biāo)記化合物也可按標(biāo)記核素是放射性核素還是穩(wěn)定核素分成放射性核素標(biāo)記化合物和穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物，統(tǒng)稱為核素標(biāo)記化合物。( 二 )標(biāo)記化合物的命名及常用術(shù)語(yǔ)1標(biāo)記化合物的命名對(duì)放射性標(biāo)記化合物的命名尚缺少統(tǒng)一法則。一般情況下，有機(jī)標(biāo)記化合物的命名，通常先指出標(biāo)記位置，再列出標(biāo)記核素，最后是化合物的名稱，如l-14

4、C-醋酸。必要時(shí)，可在核素符號(hào)的右下角注明分子內(nèi)標(biāo)記原子的數(shù)目，如DL- 苯丙氨酸 - 環(huán)2323H， - H 。無(wú)機(jī)標(biāo)記化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把標(biāo)記核素直接寫在分子式內(nèi)，如 125I- 碘化鈉或 Na125I ）。2常用術(shù)語(yǔ)標(biāo)記分子的具體情況常用下列術(shù)語(yǔ)或符號(hào)來(lái)說(shuō)明：35(l ）定位標(biāo)記（specific labeling） 即分子中的標(biāo)記原子限定在指定的位置上。常用“ S”表示，如1- 14 C（ S） - 乙酸或 1- 14C- 乙酸。表示1 位碳原子被14C 標(biāo)記。(2) 準(zhǔn)定位標(biāo)記（ nominal labeling ） 在 3H 標(biāo)記中，理論上應(yīng)獲得預(yù)期

5、的定位標(biāo)記分子，實(shí)際上， 3H 在預(yù)期位置上的分布， 有時(shí)低于化合物中 3H總量的 95，或百分比值不詳。此類標(biāo)記稱準(zhǔn)定位標(biāo)記，用“ n”表示。是一種名義上的定位標(biāo)記。(3)均勻標(biāo)記（ uniform labeling） 是一種非定位標(biāo)記（non-specific labeling），指整個(gè)分子中的某元素所有的原子均被放射性核素取代，或是放射性原子在分子中均勻地分布或者是達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的均一性。用“U”表示，如 U- 14 C- 乙酸。(4) 全標(biāo)記（ general labeling） 是非定位標(biāo)記，指分子內(nèi)所有相同的氫原子都可被3H取代，機(jī)遇各不相同。不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的均一性。用“G”表示，如

6、 G-14C- 乙酸。(5) 雙標(biāo)記或多標(biāo)記（ double labeling or multiple labeling） 指在標(biāo)記化合物內(nèi)引入兩種或兩種以上的元素的同位素，或引入一種元素的兩種或兩種以上的同位素原子，15 14如 NH2 CHCOOH。生物醫(yī)學(xué)示蹤研究中，有時(shí)將一種化合物的兩種或兩種以上單標(biāo)記物混合起來(lái)應(yīng)用，通常也稱為雙標(biāo)記或多標(biāo)記物。第二節(jié)制備標(biāo)記化合物的基本技術(shù)一 、放射性核素的選擇及標(biāo)記要求由于放射性核素有其自身的特點(diǎn)，因此選擇核素時(shí)應(yīng)注意：（ 1）有合適的核性質(zhì)。例如發(fā)射 射線的核素容易測(cè)量，往往成為制備標(biāo)記化合物的首選；半衰期不能太短，以便完成制備和實(shí)驗(yàn)；但是太長(zhǎng)的

7、壽命給處理放射性廢物帶來(lái)諸多麻煩, 以及比活度偏低，不易測(cè)量。（ 2）得到的產(chǎn)物應(yīng)與被示蹤化合物性質(zhì)盡量接近，以便得到可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論。（ 3）標(biāo)記方便，得到的化合物穩(wěn)定。放射性標(biāo)記化合物在標(biāo)記時(shí)也有一些特殊的要求：（1）標(biāo)記時(shí)應(yīng)充分利用放射性核素，標(biāo)記率應(yīng)盡量高，未標(biāo)記的核素應(yīng)注意回收利用。（ 2）放射性核素標(biāo)記是一種微量化學(xué)過(guò)程，需用微量或超微量方法進(jìn)行標(biāo)記、純化和鑒定。 標(biāo)記時(shí)應(yīng)盡量減少放射性核素的稀釋，避免加入不必要的載體。 （3）選擇標(biāo)記方法時(shí)，最好用同位素標(biāo)記；如使用非同位素標(biāo)記，則標(biāo)記核素的位置應(yīng)以不影響整個(gè)標(biāo)記分子的特定功能為佳；各種放射性核素的化學(xué)狀態(tài)不同，標(biāo)記方法也有差

8、別。 （ 4）標(biāo)記過(guò)程應(yīng)簡(jiǎn)單、快速；最好在標(biāo)記的最后階段加入放射性核素，以減少損失和污染；有條件時(shí)，在標(biāo)記前作冷實(shí)驗(yàn)，以取得經(jīng)驗(yàn)。二、標(biāo)記方法制備放射性標(biāo)記化合物的常用方法歸納如下：（一）化學(xué)合成標(biāo)記法（chemical synthesis）此方法是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將放射性核素引入化合物中。換言之，就是將放射性核素的初始原料，通過(guò)選定的工藝步驟，合成所需要的標(biāo)記化合物。此法可定位標(biāo)記，但合成36步驟較多。 14C， 3H 標(biāo)記化合物常用此法進(jìn)行合成標(biāo)記。( 二 )同位素交換標(biāo)記法（isotope exchange）一般系指兩種不同分子之間同一元素的同位素相互替代的過(guò)程，利用這個(gè)交換過(guò)程直接把某種特

9、定的放射性核素引入化合物中。該方法操作快速、簡(jiǎn)便。在放射性核素半衰期短、化學(xué)合成步驟多的情況下，該方法的實(shí)用意義更大。適用于大量有機(jī)化合物或天然產(chǎn)物的 3H 標(biāo)記，是制備 3H 標(biāo)記化合物的重要方法。( 三 )生物合成標(biāo)記法（biosynthesis）該方法是利用酶、微生物、動(dòng)植物的生理代謝過(guò)程，引入放射性核素合成有機(jī)化合物。特別是對(duì)目前尚不能用人工方法合成的物質(zhì)，如某些激素、蛋白質(zhì)、抗生素、核酸、維生素等，生物合成法則成為其惟一的制備方法。在酶的催化下，該方法合成的標(biāo)記化合物大都是具有旋光性的異構(gòu)體，產(chǎn)物不必經(jīng)過(guò)分離。用微生物或動(dòng)植物進(jìn)行生物合成的缺點(diǎn)是產(chǎn)額低，標(biāo)記位置不易控制，易造成污染。

10、此外，還有加速離子和熱原子反沖標(biāo)記法。實(shí)際上，這種反沖標(biāo)記法與中子活化標(biāo)記、輻射誘發(fā)激活標(biāo)記一樣、都屬于輻射合成標(biāo)記法。一般它們多用于化合物的3H 標(biāo)記，如甾族化合物、激素和維生素的3H標(biāo)記。三、常用的標(biāo)記化合物及其制備常用的標(biāo)記化合物通常指3H、 14C 和放射性碘標(biāo)記的化合物，目前碘標(biāo)記化合物用得比較多。（一）放射性碳的標(biāo)記化合物碳是構(gòu)成生命物質(zhì)的基本元素。在碳的放射性同位素中，生物醫(yī)學(xué)中用得最多的是14C和 11C。 14C 由反應(yīng)堆生產(chǎn)，半衰期為 5， 730 年 , 只發(fā)射 - 粒子（ 0.159 MeV ），用液閃測(cè)量很方便，外照射較弱，易防護(hù)。用于自顯影時(shí)，影像清晰。半衰期長(zhǎng)，能

11、保證連續(xù)實(shí)驗(yàn)，又不需要進(jìn)行放射性衰變校正。理論上，14C標(biāo)記化合物的放射性比活度可高達(dá)2.3088 TBq g，豐度可達(dá) 100（商品達(dá) 80以上）。與 3H 相比， 14C 標(biāo)記化合物輻射自分解速度低。由于構(gòu)成物質(zhì)的 C C 鍵比較牢固，標(biāo)記化合物中的 14C 原子也比較穩(wěn)定，所以在生物示蹤研究中很有用。11C 標(biāo)記化合物用于核醫(yī)學(xué)診斷，由加速器生產(chǎn)，它發(fā)射+ 射線，半衰期為 20.1 min ，需要用快速標(biāo)記和分離方法制備相應(yīng)的化合物。由于11C的良好核性質(zhì)，因此它的化合物，如 11C-蛋氨酸、 11C-甲基螺環(huán)哌啶酮等是 PET（proton emissiontomography ，正電

12、子發(fā)射斷層術(shù)）顯像中所用的主要放射性藥物之一。放射性碳的標(biāo)記常從最簡(jiǎn)單的化合物（如112143CO或 BaCO）開始，然后逐步合成得到所需的產(chǎn)品，可定位標(biāo)記，純化方便，放射性比活度高。14C 標(biāo)記化合物的制備方法，基本上分為化學(xué)合成法、生物合成法和輻射合成法3 類。 14C 標(biāo)記化合物制備工藝復(fù)雜，要求設(shè)備條件高和防護(hù)措施全。 一般放射性實(shí)驗(yàn)室從事14 C標(biāo)記有一定的困難。 11C的標(biāo)記通常用全自動(dòng)裝置，在幾分鐘內(nèi)可得到所需的產(chǎn)品。( 二 ) 3H 標(biāo)記化合物37-=18.4 keV ），半衰期為 12.35年，可適用于各類實(shí)驗(yàn)。3H3H 為弱 輻射體（Emax的比活度可達(dá) 1077.44GB

13、qmmol，比較容易獲得高比活度的標(biāo)記化合物。并可借助核磁共振儀鑒定3H在標(biāo)記物中的標(biāo)記結(jié)構(gòu)。3H 的豐度高， 標(biāo)記化合物的制備方法較14C 容易。一些難以用14C 標(biāo)記的化合物，如肽類、蛋白質(zhì)等，常可用3H 標(biāo)記。此外，還能作為碳骨架結(jié)構(gòu)的示蹤劑，這點(diǎn)是14C 所不及的。所以， 3H 標(biāo)記化合物的用途較廣，用化學(xué)合成法、同位素交換法和生物合成法均可制備。( 三 )放射性碘標(biāo)記化合物在醫(yī)學(xué)中常用的放射性碘有131I 、125I 、123I 、124I 等，其核性質(zhì)如表4-1 ，其中 125I和 131I 是生物醫(yī)學(xué)中最常用的放射性核素。不少有機(jī)化合物都可以進(jìn)行碘標(biāo)記，方法簡(jiǎn)單，適合制備比活度高

14、的化合物。123124131用I和 I 標(biāo)記化合物主要用于臨床功能檢查，I于甲狀腺疾病和各種腫瘤的治療，125I 標(biāo)記化合物則主要用于生物醫(yī)學(xué)研究與體外分析中。表 4-1醫(yī)學(xué)中常用的放射性碘核素半衰期衰變方式主要射線能量，MeV（分支比）123125131I13.0 hEC ： 0.159(82.9%)I60.2 dEC ： 0.035(6.7%) ，X ：0.027I8.04 d- ： 0.606(86%)， 0.336(13%) ： 0.364(81%) ，0.637(8.94%)1201.4 hI1223.6 mI1244.2 dI+ ： 0.511， ： 4.6+ ： 0.511， +

15、 ： 3.1+ ： 0.511， + ： 2.11放射性碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)和多肽放射性碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)和多肽方法很多，如一氯化碘法、電解標(biāo)記法、氯胺-T 法、乳過(guò)氧化物酶法、 Iodogen 法和聯(lián)接標(biāo)記法等。后四種方法應(yīng)用較多。（ l ）氯胺 -T （Chloramine T ， Ch-T）法這是一種微量標(biāo)記方法，最初由Greenwood和 Hunter 建立。該方法標(biāo)記率高，重復(fù)性好，是常用的經(jīng)典標(biāo)記方法。Ch-T 是一種較溫和的氧化劑，在水溶液中形成次氯酸，將陰離子-+I 氧化為分子態(tài)的碘或I，在 pH 為 7.5的環(huán)境里能與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基苯環(huán)上的H+發(fā)生置換反應(yīng)，制得碘標(biāo)記物。具體操作方

16、法舉例：在 5 g/50 L 蛋白質(zhì)（ 0.5 mol/ L的磷酸緩沖液， pH 7.5）中，依次加入 74MBq /50 L 碘 125I 化鈉（ Na125I ）， 100 g /50 L Ch-T ， 4下快速攪拌1min 后，加入200 g /100 L 偏重亞硫酸鈉（ Na2S205）終止反應(yīng)，加入 l mg /100 L 碘化鉀（ KI ），然后用 Sephadex G-25 凝膠柱分離標(biāo)記蛋白質(zhì)和游離碘。一般游離碘不超過(guò)5。其反應(yīng)式為：38氯胺 -T 法標(biāo)記 125I 反應(yīng)式Ch-T 水溶液對(duì)光和氧不穩(wěn)定，易分解，和Na2S2O5 一樣，使用前臨時(shí)配制。 Ch-T 的實(shí)際用量超過(guò)

17、理論值（按氧化74 MBq新鮮無(wú)載體的125Ch-T O.15 g），I 計(jì)算，理論上僅需Ch-T 的濃度越高，標(biāo)記率也越高，但用量過(guò)高會(huì)引起標(biāo)記物的生物活性和免疫活性降低；用量過(guò)低或局部濃度過(guò)高也能導(dǎo)致標(biāo)記率降低。嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，能減少Ch-T 對(duì)蛋白質(zhì)的損傷作用。加入 KI 是為了充分分離游離碘。反應(yīng)時(shí)間由待標(biāo)記物質(zhì)的性質(zhì)決定。綜上所述，控制 Ch-T 的濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度有利于蛋白質(zhì)的標(biāo)記。（ 2）乳過(guò)氧化物酶法即用乳過(guò)氧化物酶（lactoperoxidase， LPO）催化過(guò)氧化氫（ H 2O2）釋放出活潑的新生態(tài)氧，使 125I 離子活化并標(biāo)記在蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上的一種標(biāo)記方法

18、。此類酶催化反應(yīng)速度很快。以標(biāo)記蛋白質(zhì)為例，其方法舉例如下：37 MBq /50 L Na125I ， 2 10 g /10 L 蛋白質(zhì)， 20 100 ng /10 L LPO， 200 500 ng /10 L H 2O2混勻，反應(yīng) 10 30 min ，加入 l0 mmol/L的巰基乙醇（或緩沖液） 0.5mL終止反應(yīng)。 10 min后加入 0.1 mmol/L 的 NaI 載體溶液 100 L，按常規(guī)方法純化分離。其反應(yīng)式為：乳過(guò)氧化物酶法125I 標(biāo)記反應(yīng)式此法反應(yīng)溫和，對(duì)蛋白質(zhì)的活性損傷較小，但標(biāo)記率低。反應(yīng)期間可能出現(xiàn)LPO 自身碘化和 H 2O2 對(duì) LPO 的抑制作用。目前對(duì)

19、此法作如下的改進(jìn)：采用固相酶法，將LPO 交聯(lián)在 Sepharose 4B （瓊脂糖凝膠）固相上，解決了LPO 碘化后分離難的問(wèn)題；采用乳過(guò)氧化物酶 - 葡萄糖氧化酶（LPO-GO ）法，利用反應(yīng)過(guò)程中葡萄糖氧化產(chǎn)生的小量H 2O2，毋須外加 H2O2，使得標(biāo)記物能保持其生物學(xué)活性。由于標(biāo)記位置僅限于LPO 接近的部位，即蛋白質(zhì)分子的表面，遠(yuǎn)離活性中心，所以對(duì)保持酶、激素和抗體的活性有利。與Ch-T 法一樣 , LPO 法標(biāo)記的主要是酪氨酸殘基和少量組氨酸殘基；不同點(diǎn)是Ch-T 法不限分子表面，分子的空間因素對(duì)Ch-T 法的碘化效率影響不大，但空間因素對(duì)LPO 法標(biāo)記率卻有著重要影響。此外，L

20、PO 法不僅可以碘化標(biāo)記蛋白39多肽，也能碘化標(biāo)記各種脂肪、細(xì)胞和細(xì)胞膜。成為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要方法，尤其是固相 LPO 法標(biāo)記僅限于酶分子達(dá)到的部位，可作為大分子探針，是研究免疫應(yīng)答過(guò)程中細(xì)胞膜變化的有力手段。（ 3）固相氧化法 （ Iodogen 標(biāo)記法） 1978 年由 Fraker 和 Speck 建立的碘標(biāo)記方法。Iodogen （ l ， 3， 4 ， 6- 四氯 -3 ， 6 - 二苯基甘脲，1， 3 ， 4， 6-Tetrachloro-3 ， 6-diphenlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑 , 在碘標(biāo)記過(guò)程中起催化作用。

21、Iodogen為固相催化劑，毋須新鮮配制。催化反應(yīng)終止時(shí)不需加還原劑。具體標(biāo)記方法舉例如下：1 mg Iodogen 溶于 25 mL 二氯甲烷中，取50 L涂漬在試管底部 , 用氮?dú)獯蹈?, 密封保存于 -20 待用。標(biāo)記時(shí)向試管中加入10 g/10 L欲標(biāo)記蛋白質(zhì)（ 0.05 mmol/L 磷酸緩沖液體系， pH 為 7.4 ）和 37 MBq /10 L Na125I ，輕輕搖勻，冰浴中反應(yīng)10 min ，用 250 L 的緩沖液稀釋，以終止反應(yīng)。取出液相，通常用葡聚糖凝膠（ Sephadex）柱純化標(biāo)記品。Iodogen 標(biāo)記法具備Ch-T 法和 LPO 法的優(yōu)點(diǎn)，即標(biāo)記酪氨酸殘基不受

22、空間位置的影響。同時(shí)因固相Iodogen 不與蛋白質(zhì)密切接觸, 反應(yīng)過(guò)程中的氧化損傷小，反應(yīng)時(shí)間易控制，這一方法越來(lái)越為人所接受。此外，利用 Iodogen 不溶于水的特點(diǎn)，可直接對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行碘標(biāo)記，方法簡(jiǎn)便。 將蓋片涂 Iodogen 的一面向下漂浮在含有細(xì)胞的培養(yǎng)液上，然后向培養(yǎng)液中加入 Na125I ，細(xì)胞膜蛋白被標(biāo)記。注意不應(yīng)使用含血清和酪氨酸的培養(yǎng)液。此法已用于研究網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。（ 4）聯(lián)接標(biāo)記法（conjugation labeling ） 這是一種間接標(biāo)記方法。先使放射性碘與聯(lián)接劑相結(jié)合，然后碘標(biāo)記的聯(lián)接劑再結(jié)合到蛋白質(zhì)或多肽分子上，成為標(biāo)記化合物。此方法的基本

23、原理是：在Ch-T 作用下，先用Na125I 使酰化劑3-( 對(duì) - 羥基苯 ) 丙酸 -N 琥珀亞胺酯（ HPNS ，即 Bolton-Hunter 試劑）碘化。 125I -HPNS 通過(guò)一個(gè)酰氨鍵，與蛋白質(zhì)末端的氨基聯(lián)結(jié)，制得標(biāo)記物。其反應(yīng)式為：125I-HPNS 的苯溶液已有市售商品。標(biāo)記方法如下：取一定量125I- HPNS （每 mol 蛋白用 35 mol 碘標(biāo)試劑），用氮?dú)獯等ケ４鎰┖?，加?10 g（ 10L）預(yù)冷至0的欲標(biāo)記蛋白，混勻，調(diào)至pH 8 8.5 為宜。在冰浴中反應(yīng)15 30 min ，加入 0.5mL 0.2 mol/L甘氨酸終止反應(yīng)。 欲標(biāo)記蛋白質(zhì)與甘氨酸均用

24、0.lmol/L 硼酸緩沖液配制， 用 Sephadex G-50凝膠柱進(jìn)行分離純化。Bolton-Hunter試劑能與血清蛋白結(jié)合，因此過(guò)柱前不能用蛋白質(zhì)飽40和柱子，去除游離碘后標(biāo)記物可加蛋白質(zhì)保護(hù)。此法的優(yōu)點(diǎn)是能避免蛋白質(zhì)與氧化劑和125I的直接接觸， 防止標(biāo)記過(guò)程中引起蛋白質(zhì)變性失活，并適用于缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)的標(biāo)記。但此法操作比較麻煩，須經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)，碘利用率低。 標(biāo)記小分子會(huì)引起空間構(gòu)型的破壞，較適合標(biāo)記分子量10，000 的蛋白質(zhì)。2核酸的體外碘標(biāo)記標(biāo)記原理：加熱把DNA解析成單股，在三氯化鉈（TlCl3）氧化作用下，使125I 原子與胞嘧啶環(huán)上 5 位碳原子以穩(wěn)定的共價(jià)鍵相結(jié)合

25、，而形成5- 碘胞嘧啶。標(biāo)記方法：將8 L（ 4 g） DNA水溶液和15 L 含肝素（ 200 g/mL）的 0.2 mol/ L的醋酸鈉緩沖液（ pH為 5）混勻；加入 2 L Na125I （7.4 MBq ）和 lL TlCl （ 6 mg mL），再次混勻， 453保溫 45 min 后，冷卻至0，加入 2- 巰基乙醇終止反應(yīng)。用含有10甘油和 10 g DNA的 0.6 ml 醋酸緩沖液（0.l mol/L ， pH 為 5）稀釋；經(jīng)Sephpdex G-25 柱純化，除去游離碘和核酸以外的成分。合并含核酸的組分；用苯酚- 氯仿萃取一次，再用乙醇沉淀，保存?zhèn)溆?。本方法采用的條件溫和

26、，可避免核酸裂解、變性和電泳遷移率的改變。( 四 ) 32P 及 35S 標(biāo)記化合物-32 P 標(biāo)記的核32P 及 35S 均為 發(fā)射核素。磷和硫是核酸和蛋白質(zhì)本身所含有的元素，苷酸用于 DNA序列測(cè)定， 35S- 胱氨酸和 35S- 蛋氨酸用于研究蛋白質(zhì)代謝過(guò)程，它們均為生物醫(yī)學(xué)中不可缺少的試劑。321/235S (T 1/2=87d, Emax=0.167MeV)P（ T =14.3 d, Emax=1.71MeV）和標(biāo)記物的制備主要用化學(xué)合成、生物合成、酶促法和同位素交換法等。例如分子生物學(xué)中很重要的 - 32P-ATP（ 32P- 三磷酸腺苷） 用酶促法制備過(guò)程： 反應(yīng)液： 6mmol

27、/LMgCl2，2mmol/LL- 半胱氨酸，0.73mmol/L無(wú)水硫酸鈉, 0.33mmol/L 5 -ATP-Na, 0.1 mmol/L輔酶I,0.33mmol/L甘油酸 -3磷酸鈉鹽；酶液：200 L 甘油酸 -3- 磷酸激酶 ,60 L 甘油醛磷酸脫氫酶 ,2 mmol/L谷胱氨酸， 0.1 mmol/L輔酶 I ；標(biāo)記反應(yīng)：反應(yīng)液、酶液和H 332PO4混合，在 pH8.0 的 0.05mol/Ltris-HCl緩沖液中 ,37 ° C反應(yīng) 30min；純化：將反應(yīng)產(chǎn)物用0°C 蒸 餾 水 稀 釋 至 18mL， 用 強(qiáng) 堿 性 陰 離 子 交 換 樹 脂 柱

28、 純 化 ， 先 用 0.02mol/LNH4Cl-0.02mol/LHCl 緩沖液洗去雜質(zhì) , 然后用 0.25mol/L HCl 將 -32P-ATP 洗脫出來(lái) , 用活性炭吸附濃縮； 放化純度測(cè)定： 硅膠 G板為固定相， 用叔丁醇： 異丙醇： 20%三氯醋酸 = 13：10： 10： 0.1 （ V/V ）展開 68h。( 五 )金屬放射性核素的標(biāo)記化合物金屬放射性核素包括99Tcm、 67Ga、 111In、 90Y 、186Re、188Re、153Sm 等，它們的生物制劑被廣泛用于醫(yī)學(xué)診斷和治療中，成為標(biāo)記化合物中不可缺少的一部分。其標(biāo)記方法主要有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩類。1直接標(biāo)記法

29、直接標(biāo)記法即將金屬放射性核素直接標(biāo)記到生物大分子上，如99Tcm 和 186Re、188Re 的標(biāo)記有時(shí)采用這種方法。該法操作步驟包括：金屬核素變成能與生物大分子結(jié)合的狀態(tài)。99 Tcm 和 186Re、 188Re 均需預(yù)先進(jìn)行還原，并加入合適的絡(luò)合劑以使其低價(jià)態(tài)保持穩(wěn)定。常用的還原劑有亞錫 （ Sn2+）、連二硫酸鈉 （ Na2S2 O4）等，絡(luò)合劑有檸檬酸鹽、 葡萄糖酸鈉等。生物大分子：用抗壞血酸、 Sn2+、 Na2S2O4 等打開二硫鍵，得到還原態(tài)氫。低價(jià)態(tài)的金屬核素與打開二硫鍵的生物大分子反應(yīng)，一般用醋酸緩沖液體系，pH 5 左右，得到所需的41標(biāo)記化合物。直接標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)為標(biāo)記率

30、高，方法簡(jiǎn)單，通常不必進(jìn)一步純化；缺點(diǎn)是打開了二硫鍵，降低了標(biāo)記物的生物活性。2. 間接標(biāo)記法間接標(biāo)記法是通過(guò)連接劑將放射性核素與生物大分子連接而達(dá)到標(biāo)記目的。操作步驟為 : 連接劑與生物大分子連接， 連接劑常用雙功能螯合劑，如 DTPA（二乙基三氨基五乙酸）、DOTA （ 1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷 - N , N ', N ' ', N ' '' 四乙酸）、 2-IT （ 2-亞氨基四氫噻吩）、 2-ME （ 2-巰基乙醇）、 MAG 3（巰基乙?；拾彼幔┑龋挥肧ephadex 柱除去多余的螯合劑，得到生物大分子-螯合劑聯(lián)結(jié)物；有的

31、金屬核素如99m186188Re 需要Tc和 Re、在絡(luò)合劑存在下還原，與直接標(biāo)記相同，而6711190-螯合Ga、 In、Y 等則可直接與生物大分子劑聯(lián)結(jié)物反應(yīng)，得到相應(yīng)的標(biāo)記物；純化，除去未標(biāo)記的放射性核素和其他雜質(zhì)。間接標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)是可用于不含二硫鍵的配體標(biāo)記；缺點(diǎn)是得到合適的雙功能螯合劑較困難，對(duì)于不同的核素需要針對(duì)性地合成不同的連接劑，否則容易產(chǎn)生標(biāo)記物不穩(wěn)定、標(biāo)記產(chǎn)率低等問(wèn)題。另外，制備過(guò)程步驟多，放射性核素?fù)p失大。四、標(biāo)記化合物的純化與質(zhì)量鑒定( 一 )標(biāo)記化合物的純化各種方法得到的標(biāo)記化合物都含有一定量的雜質(zhì)，放存一段時(shí)間的標(biāo)記化合物也會(huì)出現(xiàn)分解產(chǎn)物，所以在使用前必須分離純化。

32、常用的純化方法有沉淀法、萃取法、離子交換分離法和層析分離法等。純化方法的選擇主要依據(jù)標(biāo)記化合物的化學(xué)性質(zhì)，副反應(yīng)生成的化合物的性質(zhì)，標(biāo)記化合物的產(chǎn)額，標(biāo)記時(shí)已存在的或反應(yīng)中生成的雜質(zhì)的性質(zhì)與量。( 二 )標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定指標(biāo)應(yīng)包括：放射性核素純度、放射化學(xué)純度、放射性比活度及生物學(xué)指標(biāo)。1.放射性核素純度（radionuclide purity）放射性核素純度指標(biāo)記化合物所需要的放射性核素的活度占樣品中各種核素總放射性活度的百分比，計(jì)算公式：所需放射性核素的活度放射性核素純度 %100 %樣品的總放射性活度一般要求標(biāo)記化合物的放射性核素純度應(yīng)在98以上。常用的檢查方法有

33、兩種：半衰期測(cè)定法，適用半衰期短的核素，一般跟蹤時(shí)間為35 個(gè)半衰期；射線能量測(cè)定法，利用各種放射性核素固有的能譜，檢查測(cè)定放射性核素的純度。2. 標(biāo)記率（ labeling efficiency）和放射化學(xué)純度（ radiochemical purity）所謂標(biāo)記率是指所標(biāo)記的物質(zhì)（有可能包括一種以上的化學(xué)形態(tài)）的放射性活度占樣品中總放射性活度的百分比。放射化學(xué)純度是指某一特定化學(xué)形態(tài)的標(biāo)記物的放射性活度占總放射性活度的百分比。放射化學(xué)純度一般應(yīng)達(dá)到95以上方可使用。常用的檢查方法有放射性層析法，包括電泳法、薄層色譜、紙色譜及高效液相色譜法等，有時(shí)也用放射性核素稀釋法和放射自顯影法。42標(biāo)記

34、率標(biāo)記物的放射性活度100%樣品的總放射性活度放射化學(xué)純度特定化學(xué)形態(tài)的某種核 素的放射性活度100 %該核素的總放射性活度3放射性比活度（ specific activity）放射性比活度簡(jiǎn)稱比活度，是指單位質(zhì)量物質(zhì)所含的放射性活度。用MBq/ mmol 或GBq/mmol表示。測(cè)定方法有直接測(cè)定計(jì)算法、層析掃描面積計(jì)算法等。4生物學(xué)鑒定生物學(xué)鑒定包括生物活性和免疫活性等的測(cè)定，這對(duì)體內(nèi)示蹤劑尤為重要。一般說(shuō)來(lái)，受體的生物活性可通過(guò)受體和配基結(jié)合率測(cè)定，免疫活性可通過(guò)抗體和抗原結(jié)合率測(cè)定。五、標(biāo)記化合物的貯存放射性標(biāo)記化合物除具有化合物本身的不穩(wěn)定性外，還具有放射性原子所引起的不穩(wěn)定性。用于

35、標(biāo)記的放射性核素所發(fā)出的射線能使標(biāo)記化合物自身分解，稱之為輻射自分解（ autoradiolysis ）。輻射自分解常分為 3 類：初級(jí)內(nèi)部自分解：即標(biāo)記化合物由于放射性標(biāo)記原子的核衰變而引起的原子組成的變化或化學(xué)鍵斷裂。這類分解作用是放射性核素固有的物理特性，無(wú)法人為地控制和防止。初級(jí)外輻射分解：即放射性標(biāo)記原子發(fā)射的射線直接作用于化合物分子，引起分子化合鏈斷裂，造成化合物分解。這類外輻射分解作用與標(biāo)記化合物的濃度有關(guān)。次級(jí)輻射分解：放射性標(biāo)記化合物或其周圍介質(zhì)的分子，由于射線與物質(zhì)相互作用而產(chǎn)生一系列活性游離基團(tuán)，如H 、OH 、HO 2 等，這些活性基團(tuán)又與標(biāo)記化合物分子相互作用，使得化

36、合物分解。 次級(jí)輻射分解作用對(duì)3H 和 14 C標(biāo)記化合物更重要。標(biāo)記化合物的輻射自分解主要與標(biāo)記化合物吸收射線能量的效率、標(biāo)記化合物的濃度和比活度有關(guān)。 標(biāo)記化合物發(fā)生輻射分解的百分?jǐn)?shù)用G值表示， 即以系統(tǒng)每吸收 100eV 射線能量后發(fā)生變化（不論生成或破壞）的分子數(shù)目表示。應(yīng)指出，除了輻射自分解以外，標(biāo)記化合物還會(huì)發(fā)生化學(xué)分解，標(biāo)記化合物本身的不穩(wěn)定性引起儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生分解，如水解、氧化、聚合等。對(duì)于氚，還會(huì)發(fā)生同位素交換反應(yīng)，標(biāo)記化合物分子的某些基團(tuán)，如-SH、 -NH 、 -COOH、 NH 中的標(biāo)記氚原子都不穩(wěn)定2（稱為不穩(wěn)定氚） ，在極性溶劑中能與氫或其他元素發(fā)生交換而失去氚。標(biāo)

37、記化合物的儲(chǔ)存原則：降低標(biāo)記物比活度。固體純品貯存輻射自分解最嚴(yán)重，以液態(tài)貯存較好。稀釋。在貯存高純度的標(biāo)記化合物時(shí)常用非標(biāo)記的化合物稀釋。選擇稀釋劑時(shí)，主要采用不易產(chǎn)生自由基的溶液作稀釋劑，如苯。惰性氣體環(huán)境，以防止標(biāo)記物氧化。低溫保存。以低溫度但不結(jié)冰條件下（2 0C4 0C）避光貯存標(biāo)記化合物為好。對(duì) 3H 的標(biāo)記化合物來(lái)說(shuō)也可采用深凍（-1400C）保存。第三節(jié)穩(wěn)定核素及其他標(biāo)記化合物43一、穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物穩(wěn)定核素（ stable nuclide）是一類原子核不發(fā)射射線的核素，包括不自發(fā)地發(fā)生核內(nèi)成分或能級(jí)變化或發(fā)生概率非常?。ㄍǔＶ?T1/2 109 ，也有人定義為T1/2 10

38、15 ）的核素。醫(yī)學(xué)生物學(xué)中最有用的穩(wěn)定核素（H、C、 N、O、 S）大多數(shù)為輕元素的重同位素；少數(shù)為輕同位素。自然界存在的各種元素，大多數(shù)不止有一種穩(wěn)定核素，它們相互混合，以恒定的比例存在于各種化合物之中。習(xí)慣上把其中比例最高的核素稱為主要核素，如16 O，其余比例較低的稱為主要核素的穩(wěn)定同位素（stable isotope），如 17O 和 18 O。天然存在的穩(wěn)定核 素的原子數(shù)與該元素總原子數(shù)的百分比，即該穩(wěn)定核素的天然豐度（naturalabundance ）。它是穩(wěn)定核素測(cè)量時(shí)的本底來(lái)源之一，能直接影響測(cè)量的靈敏度。所以，應(yīng)用時(shí)應(yīng)盡量地選擇天然豐度低的核素。穩(wěn)定核素的生產(chǎn)，與放射性核

39、素不同，主要是通過(guò)理化方法，從天然存在的某一元素的各種穩(wěn)定核素的混合物中分離出所需的核素。常用的方法有質(zhì)量分離法、同位素交換法和富集法（ enrichment ）等。穩(wěn)定核素的標(biāo)記化合物（labeled compound of stable nuclide）的制備，與放射性核素標(biāo)記物的制備方法基本相似，也分為化學(xué)合成法、生物合成法及同位素交換三大類。穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物制備規(guī)模相對(duì)比較大，多在數(shù)10 mg 到 100 g 之間，要求穩(wěn)定核素豐度高。因不存在核素衰變問(wèn)題，不要求快速合成，故制備過(guò)程并不完全與放射性標(biāo)記過(guò)程相同。如用重水為原料，采用反復(fù)交換步驟可獲得豐度很高的氘標(biāo)記化合物。另外，穩(wěn)定

40、核素大多比較昂貴，因此制備過(guò)程中要求充分利用原料，并盡量回收未標(biāo)記的部分。近年來(lái)，隨著穩(wěn)定核素應(yīng)用的擴(kuò)大，穩(wěn)定核素標(biāo)記技術(shù)已向多標(biāo)記發(fā)展，并越來(lái)越多采用分子內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，即一個(gè)分子上標(biāo)記多個(gè)同種或不同種類的穩(wěn)定核素的原子。同時(shí)，對(duì)標(biāo)記的部位也提出了更嚴(yán)格的要求，并注意到標(biāo)記化合物的立體特異性。除化學(xué)純度外，標(biāo)記化合物的豐度成為穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo)。標(biāo)記化合物的豐度有兩個(gè)含義：原子豐度（ atomic abundance ）和分子豐度（ molecularabundance ）。原子豐度是指標(biāo)記分子某一特定位置上的原子中標(biāo)記原子所占的百分比。原子豐度包括該標(biāo)記核素的天然豐度，所以有人也用原子百分超（atom excess ）來(lái)度量標(biāo)記原子的含量。原子百分超 =原子豐度 - 天然豐度。分子豐度：是指每 100 個(gè)分子中帶標(biāo)記核素的分子有多少。其中包括由天然穩(wěn)定核素形成的、與標(biāo)記物相同的分子。2H、 13C、15N、 50Cr 等穩(wěn)定核素標(biāo)記的化合物已廣泛地用于物質(zhì)代謝、血容量及腎功