第2章DNA重組(3DNA片段的連接重組)

1、第二章 DNA重組 自學(xué)為主4 DNA的化學(xué)合成的化學(xué)合成與與DNA的凝膠電泳的凝膠電泳5 DNA片段的連接重組片段的連接重組5.1 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn) 1967年，世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶(ligase)。 這種酶需要在一條DNA鏈的3-末端具有一個(gè)游離的羥基(-OH)，和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(-P)，只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，DNA連接酶催化的連接反應(yīng)，是利用NAD煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的；而在動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用

2、ATP腺苷三磷酸作能源。 DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)分子或環(huán)化的單鏈化的單鏈DNA分子分子，被連接的鏈必須是雙螺旋的一部分。實(shí)際上，DNA連接酶是封閉雙螺旋封閉雙螺旋DNA骨架上的切口骨架上的切口(nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。5.2 DNA連接酶的基本性質(zhì)連接酶的基本性質(zhì) 修復(fù)雙鏈修復(fù)雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵上切口處的磷酸二酯鍵5G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33C-G-AG A-C-G-T-C-C-T-C 5OH PP OH5G-C-T-C-T-G-C-A-G-

3、G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknickDNA連接酶連接酶 修復(fù)與修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的鏈結(jié)合的DNA鏈上切口處的磷鏈上切口處的磷酸二酯鍵酸二酯鍵5G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 55G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G- A-C-G-T-C-C-T-C 5P OHDNA連接酶連接酶nick 連接多個(gè)平頭雙鏈連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子分子5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5P-C-A-G-G

4、-A-G 3OH-G-T-C-C-T-C 5DNA連接酶連接酶5G-C-T-C-T-G-OH3C-G-A-G-A-C-P5.3 分類分類DNA連接酶連接酶T4DNA連接酶連接酶來源來源大腸桿菌大腸桿菌T4噬菌體噬菌體能源輔助因子能源輔助因子 NAD+ATP功能功能催化催化DNA粘性末端粘性末端的連接的連接粘性末端、平末粘性末端、平末端均可連接端均可連接10連接緩沖液連接緩沖液 1.0L目的序列回收產(chǎn)目的序列回收產(chǎn)物物5.0LT4 DNA連接酶連接酶（3U/ L）0.5L雙酶切后的植物雙酶切后的植物表達(dá)載體表達(dá)載體3.5L總體積總體積10.0L 1U DNA連接酶的酶活連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)

5、條件下性：在最佳反應(yīng)條件下15 反應(yīng)反應(yīng)1 小時(shí)小時(shí)，完全，完全連接連接1g-DNA（HindIII片段）所需的片段）所需的酶量酶量5.4 DNA連接酶的反應(yīng)體系連接酶的反應(yīng)體系某植物表達(dá)載體的連接體系某植物表達(dá)載體的連接體系 連接酶連接切口DNA的最佳反應(yīng)溫度是37。但是在這個(gè)溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此，連接粘性末端的最佳溫度，應(yīng)是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為415比較合適。 平末端的連接采用T4DNA聚合酶，可在較高的溫度進(jìn)行，如22 。 同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的連接 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接 不同粘性末端的連接5.5 體外連接體外連接DNA片段的方式

6、片段的方式粘粘性性末末端端 平末端的直接連接 末端修飾后的連接 加上連桿（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA連接酶連接 DNA接頭(adapter)連接法具粘性末端的具粘性末端的DNA片段的連接比較容易片段的連接比較容易，也較常用。，也較常用。5.5.1同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的連接同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的連接GAATTCCTTAAG55GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG55EcoRI GCTTAA55AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG5AATTCGGCTTAA5T4DNA連接酶連接酶退火退火GCTTAAGCTTAA5AATTCG5AA

7、TTCG5.5.2同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接TGATCAACTAGT55GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG55BclI BamHITACTAG55GATCATGCCTAGGATCCGT4DNA連接酶連接酶退火退火GCCTAGGATCCG5GATCATTACTAG5GCCTAGGATCCG5GATCATGCTTAA55.5.3不同粘性末端的連接不同粘性末端的連接CTGCAGGACGTC55GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG55BamHIPstI CTGCAG55GACGTCGCCTAGGATCCGT4-DNA pol切平切平Klenow補(bǔ)平補(bǔ)

8、平CG55GCGGATCCCTAGGATCCCTAGGT4DNA ligaseGCCTAGGATCCG5GATCGCCGCTAG5GCCTAGGATCCG5GATCGCCGCTAG55.5.4平末端的直接連接平末端的直接連接 從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì) 加入10% PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用 加入單價(jià)陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mM5

9、.5.4平末端的直接連接平末端的直接連接（1）直接用T4DNA連接酶連接；（2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接；（3）用連桿連接平末端DNA分子；（4）DNA接頭連接法。直接用直接用T4DNA連接酶連接平末端連接酶連接平末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5P-C-A-G-G-A-G 3OH-G-T-C-C-T-C 5DNA連接酶連接酶5G-C-T-C-T-G-OH3C-G-A-G-A-C-P5.5.5末端修飾后的連接末端修飾后的連接 DNA片段末端同聚物加尾同聚物加尾后連

10、接（用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）給具平末端的DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來） 粘性末端修飾成平末端粘性末端修飾成平末端后再連接DNA片段末端同聚物加尾后連接片段末端同聚物加尾后連接3突出末端突出末端GCATG3 C55C3GTACGTdTdCTPTdTdGTPGCATGCCCCCC3 C55C3CCCCCCGTACG退火退火 KlenowT4DNA ligasePstISphICTGCA 3GG3 ACGTC55CTGCAGGGGGG 3GG3 GGGGGGACGTC55CTGCAGGGGG

11、GGGGGGGGGACGTC55GCATGCCCCCC C55CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGGGGGGGGACGTC55GCATGCCCCCC C55CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCC CGTAC55CATGCCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCC CGTAC55CATGCCCCCCCGTACGPstI酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)粘性末端修飾成平末端后再連接粘性末端修飾成平末端后再連接GCTTAA55AATTCGEcoRIBamHIGAATTC

12、TTAA55AATTCTTAAGKlenow補(bǔ)平補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平補(bǔ)平GAATTGGGGGGCTTAA55AATTCGGGGGGTTAAGTdTdGTPGCCTAGGATCCG55GGATCCCTAGGATCCCTAGG55GGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGG55TdTdCTPT4DNA ligaseGAATTGGGGGGCTTAA55AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGCTTAA55AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGBa

13、mHI酶酶切位點(diǎn)切位點(diǎn)5突出末端突出末端5.5.6加上連桿后再連接加上連桿后再連接 如果重組體DNA是用平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么很可能無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入DNA片段。為了解決這個(gè)問題，可采用連桿法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。 所謂連桿(1inker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由1012個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。 DNA片段末端加上化學(xué)合成的連桿或接頭，能形成粘性末端，連接后可用內(nèi)切酶進(jìn)行切割。 連桿的5-末端和待克隆的DNA片段5-末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通過T4DNA連接酶的作用使兩者連

14、接起來。接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂羞B桿的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補(bǔ)的粘性末端。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來 DNA連桿連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的連桿相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化連桿產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。 當(dāng)然，在遇到這種情況時(shí)，一個(gè)方法可改用其它類型的連桿，另一種公認(rèn)的較好的替代辦法是改用DNA接頭(adapter)連接法。 5.5.7DNA接頭(adapter)連接法 于1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。小結(jié)：平末端小結(jié)：平末端DNA片段的連接片段的連接（1）直接用T4DNA連接酶連接；（2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接；（3）用連桿連接平末端DNA分子；（4）DNA接頭連接法。 基因工程中