園林植物遺傳育種學(xué)試驗(yàn)參考指導(dǎo)書(shū)(共41頁(yè))

1、園林植物遺傳育種學(xué)試驗(yàn)參考指導(dǎo)書(shū)園林植物遺傳育種學(xué)課程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)園林專(zhuān)業(yè)楊泉女 鄧日烈 劉曉輝 編佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院園藝系2008年5月目 錄實(shí)驗(yàn)一、園林植物品種性狀的描述 2 實(shí)驗(yàn)二、園林植物種質(zhì)資源調(diào)查3實(shí)驗(yàn)三、花粉生活力的鑒定5實(shí)驗(yàn)四、園林植物開(kāi)花習(xí)性的觀察與授粉技術(shù)7 實(shí)驗(yàn)五、人工誘發(fā)植物多倍體9 實(shí)驗(yàn)六、植物培養(yǎng)基的配制與滅菌11 實(shí)驗(yàn)七、園林植物的組織培養(yǎng)13 實(shí)驗(yàn)一、園林植物品種性狀的描述植物表型變異類(lèi)型的觀察植物表型變異的研究是進(jìn)行表型選擇的工作基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)表型選擇出來(lái)的類(lèi)型r一般就直接稱(chēng)為優(yōu)良類(lèi)型，這些優(yōu)良類(lèi)型一方面可直接供生產(chǎn)之需，另一方面可作為該植物種進(jìn)一步改良的

2、原始材料。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步掌握植物表型變異類(lèi)型劃分的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)用具 手持放大鏡、鉛筆、繪圖紙、枝剪、小刀、米尺。三、實(shí)驗(yàn)材料 各種樹(shù)木和花卉品種。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 (一)樹(shù)木形態(tài)特征變異的觀察 (1)葉子形態(tài)特征的變化。許多喬灌木樹(shù)種葉子的結(jié)構(gòu)和色澤存在一定的變化，并在綠化事業(yè)上廣泛應(yīng)用著，如園柏的針葉有刺葉和鱗葉之分；槭樹(shù)和黃盧的紅葉中，存在深紅、淡紅和黃色三種類(lèi)型；李子樹(shù)中還發(fā)生了保持全年樹(shù)葉紫紅的變異，這就是紅葉李；各種楊樹(shù)、柳樹(shù)的葉形和葉片大小也存在著一定的差異。 (2)果實(shí)(球果)形態(tài)特征的變異。果實(shí)(球果)是樹(shù)木重要的繁殖器官，也是劃分種、品種和類(lèi)型的重要的性狀特

3、征。核桃果實(shí)按形狀可劃分為：尖頂、卵果、長(zhǎng)果、圓果、方果等五種類(lèi)型：按種殼光滑程度可分為光、中等光滑和有皺溝三種類(lèi)型：接種殼厚度及其內(nèi)壁構(gòu)造(內(nèi)壁褶、內(nèi)壁膜、種殼)可劃分為露仁、薄殼、錦仁、夾綿、夾仁、節(jié)子等六大類(lèi)型。 (3)樹(shù)皮形態(tài)特征的變化。許多樹(shù)種樹(shù)皮的色澤、光滑度、裂縫的狀況(形狀、深裂度、裂縫的色澤)和裂片的形狀均存在一定的差別，如楊樹(shù)、柳樹(shù)、榆樹(shù)飛泡桐和松樹(shù)等樹(shù)種均可見(jiàn)到。 (4)樹(shù)木冠形和分枝習(xí)性的變化。樹(shù)木的冠形和分枝習(xí)性是重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一。特別是在綠化事業(yè)上非常重視這些性狀。樹(shù)木的冠形，例如園柏、鉛筆柏等樹(shù)種可分為塔型（尖塔型、圓錐狀塔型、圓柱狀塔型），橢圓形和卵形等形狀。

4、樹(shù)木的分枝習(xí)性以雪松為例，可分類(lèi)水平狀、下垂?fàn)睿ㄋ詈秃藸睿⑿闭範(fàn)詈蜐舛葼畹人姆N形式。另外在園林綠化中的扭枝狀，如龍爪柳、龍爪桑，垂枝狀如龍爪槐、垂柳、線柏等。 （二）花卉植物形態(tài)特征變異的觀察 花瓣形態(tài)特征的變化，在許多花卉植物中有單瓣型、重瓣型、皺瓣型等。重瓣型除觀察價(jià)值提高外，在某些可做食品或提取香精的種類(lèi)中，還提高了它們的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在平展的花瓣上發(fā)生卷曲，波緣或皺折，可大大增加觀賞價(jià)值。五、實(shí)驗(yàn)作業(yè) 通過(guò)觀察，詳細(xì)記載兩種樹(shù)木或花卉的變異類(lèi)型特征，并用繪圖、拍照等方法加以說(shuō)明，寫(xiě)出觀察報(bào)告。實(shí)驗(yàn)二、園林植物種質(zhì)資源調(diào)查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)對(duì)園林植物的品種資源進(jìn)行調(diào)查研究，掌握鑒定品種特

5、性的方法，了解品種間和品種內(nèi)的變異。 二、實(shí)驗(yàn)材料 喬木：短穗魚(yú)尾葵（Caryota mitis）；大花紫薇（Lagerstroemia speciosa）；黃槐（Cassia surattensis）；雞蛋花（Plumeria rubra acutifolia）。灌木：棕竹（Rhapis excelsa）；紅檵木（Loropetalum chinense rubrum）；變?nèi)~木（Codiaeum variegatum pictum）；紅桑（Acalypha wilkesiana）；馬纓丹（Lantana camara）；軟枝黃蟬（Allamanda cathartica）；福建茶（Carmo

6、na microphylla）。草本：水鬼蕉（Hymenocallis Americana）；艷山姜（Alpinia zerumbet 'variegata'）。花卉：彩葉草（Coleus blumei）；梔子（Gardenia jasminoides）；千日紅（Gomphrena globosa）；長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）。三、實(shí)驗(yàn)用具 測(cè)高器、標(biāo)桿、皮尺、鋼卷尺、直尺、鉛筆、記錄板等。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 觀測(cè)不同植物品種的園林與經(jīng)濟(jì)性狀，包括株型、花、果實(shí)、抗性等特征，對(duì)其進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。具體觀測(cè)性狀如下： 1 株型：包括株高、枝下高、冠長(zhǎng)、冠幅（株幅）

7、、冠形、分枝角度、分枝數(shù)、枝葉的特征、植株生長(zhǎng)情況等。 2 花的特征：包括花期、花型、花朵大小、花色、花香、開(kāi)花數(shù)量等。 3 結(jié)實(shí)情況：包括果實(shí)的形狀、大小、多少等。 4 抗性：包括抗寒性、抗熱性、抗旱性、抗病性、抗蟲(chóng)性、耐陰性等。 5 特殊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值或園林價(jià)值 五、實(shí)驗(yàn)方法與操作步驟 1 每 4 5 人為 1 組，每小組測(cè)量 2 3 個(gè)品種。每小組測(cè)量該品種 4-5株。 2 每株都應(yīng)按要求調(diào)查的內(nèi)容進(jìn)行觀測(cè)記載。 3 數(shù)量性狀一般按三級(jí)記載，比如： 香味：濃、一般、較淡 花量或結(jié)實(shí)：多、中等、少 抗性：強(qiáng)、中、弱 六、作業(yè)及思考題 1自己設(shè)計(jì)并填寫(xiě)好不同品種間性狀差異表。 2對(duì)不同品種的綜合

8、性狀及立地條件進(jìn)行評(píng)估。3談?wù)剤@林植物品種資源研究的方法和意義。舉例：大花紫薇（Lagerstroemia speciosa）千屈菜科（Lythraceae） 1.一般特性：大喬木，高可達(dá)20米。2.葉：葉具短柄，革質(zhì)，矩圓形橢圓形或者卵狀橢圓形，長(zhǎng)1025厘米，寬610厘米，先端鈍或短漸尖。3.花：花淡紅色，直徑約5厘米，排成一大而頂生的圓錐花序；萼有棱或槽口，被秕糠狀柔毛，裂片外反；花瓣6枚，矩圓形或倒卵形，具短柄，長(zhǎng)2.53.5厘米；雄蕊100200枚。4.花期：夏秋間。5.果：蒴果球形，長(zhǎng)約2.5厘米。6.生態(tài)分布：印度至中國(guó)南部。7.備注：為一美麗的庭院園林植物，木材堅(jiān)挺，耐朽力強(qiáng)，

9、色紅而亮，極宜于制造家具，舟車(chē)，橋梁，電柱，建筑等用，其在經(jīng)濟(jì)上的價(jià)值足與柚木比擬。棕竹（Rhapis excelsa）檳榔科（棕櫚科）（Palmaceae） 1.一般特性：灌木，高23米。2.葉：掌狀410深裂，裂片擴(kuò)展，邊和中脈上有極小的暗褐色的鋸齒，先端闊，有不規(guī)則的齒缺，中脈間有網(wǎng)脈；葉柄扁平，邊多少粗糙，基部有纖維。3.花：花序短于葉，生于葉叢中；佛焰苞數(shù)枚，淡黃色，膜質(zhì)，被毛；花黃色，無(wú)柄，小。4.花期：5月。5.果：球形，直徑810毫米。6.生態(tài)分布：中國(guó)和日本。7.備注：庭園和盆栽園林植物，廣州常見(jiàn)栽培。干直而靱，可為手杖、鞭、傘柄等。艷山姜（Alpinia zerumbet

10、'variegata'）姜科（Zingiberales）1.多年生草本。 2.葉片披針形，頂端漸尖而有一旋卷的小尖頭，邊緣具柔毛，余無(wú)毛或有時(shí)于下面被毛。 3.圓錐花序成總狀花序式，下垂。苞片白色，頂端及基部粉紅色，花萼近鐘狀，萼片乳白色，4.頂端粉紅，唇瓣匙狀，寬卵形，黃色而有紫紅色條紋。 5.蒴果球形，被毛，有條紋，熟時(shí)橙紅色。 6.分布于我國(guó)東南部至西南部，亞洲熱帶其他地區(qū)也有，生于林蔭下， 7.種子供藥用，有燥濕祛寒，健脾胃之效。實(shí)驗(yàn)三、花粉生活力的鑒定花期不遇給雜交工作造成困難，有的園林植物可通過(guò)調(diào)整花期來(lái)解決，有的則不得不進(jìn)行花粉貯藏，或者從外地寄運(yùn)花粉。為了避免雜

11、交工作失誤，在使用外地寄來(lái)的花粉或經(jīng)過(guò)一段時(shí)間貯藏的花粉之前，必須對(duì)花粉的生活力進(jìn)行檢測(cè)，以便提高雜交效率。因此我們必須掌握花粉貯藏及花粉生活力測(cè)定的原理和技術(shù) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握花粉貯藏及花粉生命力鑒定的方法和原理。 二、實(shí)驗(yàn)材料 一串紅、矮牽牛、油茶等植物的花粉。 三、儀器及藥品 載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、毛筆、干燥器、小指形管、標(biāo)簽、記號(hào)筆、顯微鏡、天平、燒杯、培養(yǎng)皿、滴管、玻璃棒、量筒、電爐、石棉網(wǎng)、冰箱； 凡士林、無(wú)水氯化鈣、蔗糖、瓊脂、蒸餾水、硼酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碘、碘化鉀、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。 四、實(shí)驗(yàn)原理 花粉在低溫（ 0 2 ）、干燥、黑暗等條件下代

12、謝強(qiáng)度降低，花粉貯藏的原理就是要?jiǎng)?chuàng)造這樣低代謝的環(huán)境條件，從而延長(zhǎng)花粉的壽命。 花粉的形態(tài)、花粉中酶的活性以及積累淀粉的多少（淀粉質(zhì)花粉）通常與其生活力密切相關(guān)，因此可以利用花粉的形態(tài)觀察、過(guò)氧化物酶、脫氫酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培養(yǎng)基上花粉管萌發(fā)的情況作為鑒定花粉生活力高低的標(biāo)準(zhǔn)。 鑒定花粉生活力的方法很多，概括起來(lái)主要有如下幾種： 1 直接測(cè)定法： 將待測(cè)花粉直接授粉，然后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)情況。此法最準(zhǔn)確，但需時(shí)較長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受氣候條件的影響。也可在授粉后隔一定時(shí)間切下柱頭，在顯微鏡下壓片檢查花粉的萌發(fā)情況，根據(jù)萌發(fā)率的高低來(lái)鑒定花粉的生活力。 2 形態(tài)觀察法： 直接在顯微鏡下觀察花

13、粉的形態(tài)，根據(jù)品種花粉的典型性（如具有正常的大小、形狀、色澤等）判斷花粉的生活力，即形態(tài)正常的花粉有生活力，而一些小的、皺縮的、畸形的花粉不具有生活力。此法簡(jiǎn)便易行但準(zhǔn)確性差，一般只用于測(cè)定新鮮花粉的生活力。 3 染色觀察法： 1 ）碘碘化鉀染色法：以碘碘化鉀溶液（ 0.3g 碘 1.3g 碘化鉀溶于 100ml 蒸餾水）染色后于顯微鏡下觀察，花粉被染成藍(lán)色者表示具有生活力，花粉呈黃褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法： TTC 染色是一種鑒定去氫酶活性的組織化學(xué)反應(yīng)，凡具有生活力的花粉在其呼吸過(guò)程中都有氧化還原作用，當(dāng) TTC 滲入有活力的花粉時(shí)，其去氫酶在催化去氫過(guò)程中與 TTC

14、結(jié)合，使無(wú)色的 TTC 變成 TTF 而呈現(xiàn)紅色。 4 培養(yǎng)基發(fā)芽法 在培養(yǎng)基上進(jìn)行花粉的人工萌發(fā)，鑒定待測(cè)花粉萌發(fā)率的高低。此法若采用適宜的培養(yǎng)基能較精確地測(cè)定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌發(fā)條件存在較大的差異，所以很多時(shí)候測(cè)定的結(jié)果也只是相對(duì)可靠。 五、實(shí)驗(yàn)步驟： 花粉的貯藏： （）將采集的花粉進(jìn)行干燥（涼干或放入盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏結(jié)為度。 （）將干燥的花粉裝在指形管中（不要太多，一般以五分之一體積或更少為宜），瓶口塞以紗布，瓶外貼以標(biāo)簽，注明花粉種類(lèi)、采收日期。 （）將指形管放入無(wú)水氯化鈣控制一定濕度的干燥器中，干燥器置于 0 2 的冰箱內(nèi)。 花粉生活

15、力的測(cè)定： （）染色觀察法 TTC 染色法 配制 TTC 染色液：稱(chēng)取 0.5g TTC 溶于 100ml 磷酸鹽緩沖液（ 100ml 蒸餾水中溶解 0.832g Na2HPO 4 2H2O 和 0.273g KH 2 PO4， pH7.2 ）中，裝入棕色瓶備用。 制片：取少量花粉于載玻片上，滴入 1 2 滴 0.5 TTC 染色液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，于 35 40 條件下凈置 15 20min 。 觀察統(tǒng)計(jì)：在顯微鏡下觀察三個(gè)不同的視野，凡被染成紅色或玫瑰紅的都是有生活力的花粉，黃色或不著色者為沒(méi)有生活力的花粉。 （）培養(yǎng)基發(fā)芽法 固體培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基：稱(chēng)取 1g 瓊脂， 5g

16、蔗糖，量取 94ml 蒸餾水，裝入燒杯，加熱使瓊脂融化呈透明狀（注意補(bǔ)充水分，以保持培養(yǎng)基的濃度），即配成 5% 濃度的培養(yǎng)基。同法配制 10% 、 15% 、 20% 濃度的培養(yǎng)基。 制片：用滴管吸取少量培養(yǎng)基，趁熱滴在載玻片的凹槽內(nèi)，放置片刻，使其凝固。 播種花粉：將少量花粉均勻地撒播在培養(yǎng)基上，注意不可過(guò)多，否則難以觀察。 培養(yǎng)與觀察：將制備好的片子放在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于 20 22 的溫箱中培養(yǎng)；待花粉萌發(fā)后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。觀察時(shí)每片隨機(jī)取三個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉總數(shù)及發(fā)芽數(shù)，計(jì)算平均萌發(fā)率（花粉總數(shù)不少于 100 粒）。 六、作業(yè)及思考題： 、按下表統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 染色法

17、測(cè)定結(jié)果記載表花粉來(lái)源各視野中花粉粒數(shù)量及生活力平均生活力()花粉總數(shù)其中花粉總數(shù) 其中 花粉總數(shù) 其中 紅色黃色生活力紅色黃色生活力紅色黃色生活力                            培養(yǎng)基法測(cè)定結(jié)果記載表花粉來(lái)源培養(yǎng)基濃度各視野中花粉粒數(shù)量及發(fā)芽率平均生活力()123發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)

18、發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率                                         、繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。 、比較不同方法、不同濃度（培養(yǎng)基法）測(cè)得花粉生活力的高低，分析其原因。 實(shí)驗(yàn)四、園林植物開(kāi)花習(xí)性的觀察與授粉技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)對(duì)園林

19、植物花器結(jié)構(gòu)及開(kāi)花授粉習(xí)性的觀察，了解不同園林植物種類(lèi)的花器官結(jié)構(gòu)特征與開(kāi)花授粉特點(diǎn)，以及兩者之間的關(guān)系；熟悉園林植物開(kāi)花習(xí)性調(diào)查的主要觀察項(xiàng)目和觀察方法。 二、實(shí)驗(yàn)材料 懸鈴木、月季、菊花、矮牽牛、石竹、金魚(yú)草等園林植物。 三、實(shí)驗(yàn)用具 放大鏡、解剖針、鑷子、剪刀、直尺、記錄板等。 四、實(shí)驗(yàn)原理 不同的園林植物因其自身的發(fā)育特點(diǎn)不同，往往具有不同的花器官結(jié)構(gòu)特征和開(kāi)花授粉習(xí)性。如有的園林植物為風(fēng)媒花，而有的園林植物則靠蜜蜂、蝴蝶等傳粉媒介進(jìn)行授粉；有的植物花器官結(jié)構(gòu)便于自花授粉，而有的則便于異花授粉。此項(xiàng)觀察可作為識(shí)別品種、制定雜交計(jì)劃的主要依據(jù)，也可為采留種子，選育不育系等提供理論依據(jù)。

20、五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 以懸鈴木、月季、菊花、矮牽牛、石竹、金魚(yú)草等園林植物為材料，詳細(xì)觀察其花器官的組成與結(jié)構(gòu)特征，了解其開(kāi)花授粉特點(diǎn)。 1 花器結(jié)構(gòu)的觀察 一般兩性花植物的花朵由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官組成，多數(shù)植物的花朵基部還著生有花苞片，而單性花則缺少其中的雄蕊或雌蕊。通過(guò)觀察比較，明確不同園林植物的花部構(gòu)造及其形態(tài)特征，了解授粉習(xí)性與其之間的關(guān)系。 2 開(kāi)花授粉習(xí)性的觀察 1 ）花芽類(lèi)型：植物花芽的類(lèi)型基本上可以分為純花芽和混合花芽?jī)煞N類(lèi)型。純花其芽?jī)?nèi)只有花器官，芽 萌發(fā)后，只開(kāi)花結(jié)果，不抽生枝條，多數(shù)花卉屬于此類(lèi)； 混合花芽在芽?jī)?nèi)除有花器官外，還存在枝葉或葉的原始體，開(kāi)花的同時(shí)可抽生枝

21、條，如懸鈴木等。 2 ）開(kāi)花時(shí)間及花期長(zhǎng)短：不同的園林植物其開(kāi)花時(shí)間差異較大，如梅花、玉蘭、連翹等在早春開(kāi)花，懸鈴木、牡丹、芍藥等春季開(kāi)花，荷花夏天開(kāi)，菊花秋天開(kāi)，蠟梅則怒放于冬季，而月季、矮牽牛、四季桂等一年四季均能開(kāi)花。此外，不同品種的始花期、盛花期、終花期及整個(gè)開(kāi)花過(guò)程的長(zhǎng)短也不相同。通過(guò)觀察明確不同植物及品種的花期和開(kāi)花規(guī)律對(duì)于人工雜交具有重要的指導(dǎo)意義。 3 ）花型：包括單瓣、重瓣，大花、小花等?；ㄐ偷谋憩F(xiàn)對(duì)于植物的傳粉和結(jié)實(shí)會(huì)產(chǎn)生影響。 4 ）花性：包括雌雄異株、雌雄同株異花和雌雄同花（兩性花）。有些植物在一個(gè)植株上既有兩性花又有單性花；還有些植物盡管具有兩性花，但表現(xiàn)為雄蕊或雌蕊

22、退化。 5 ）花瓣：花瓣的顏色、形態(tài)等表現(xiàn)往往與植物的傳粉方式和授粉習(xí)性有較大的關(guān)系。如開(kāi)花時(shí)花瓣緊閉者（金魚(yú)草等）一般采用自花授粉。 6 ）雄蕊和雌蕊：雄性和雌蕊的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)、著生方式與植物的授粉特點(diǎn)、結(jié)實(shí)能力等有很大的關(guān)系。 7 ）花粉：花粉是植物自然授粉和人工雜交的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。同樣的兩性花品種，花藥中產(chǎn)生花粉的多少是不同的，有些很多，有些中等，有些則很少。 六、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：查閱資料了解所選的實(shí)驗(yàn)材料花器官結(jié)構(gòu)特征和開(kāi)花授粉習(xí)性的相關(guān)知識(shí)。 2分組：每 3 4 人為 1 組，領(lǐng)取實(shí)驗(yàn)工具。3、親本的選擇與選配4、親本植株和花朵的選擇5、去雄、套袋6、花粉采集貯藏7、授粉

23、8、雜交后的養(yǎng)護(hù)管理9、雜種種子的采收七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 1、查閱資料了解幾種觀賞植物開(kāi)花授粉的相關(guān)知識(shí)美人蕉花器構(gòu)造：大而鮮紅艷麗部分是5枚特化為花瓣?duì)畹男廴?，其中一枚反卷稱(chēng)“唇瓣”。 3枚長(zhǎng)卵形的萼片，3枚披針形、狹而尖的花瓣。傳粉介質(zhì)：昆蟲(chóng)開(kāi)花習(xí)性：2填寫(xiě)雜交結(jié)果記載表 雜交組合去雄日期花粉采集日期授粉日期授粉花數(shù)采種日期結(jié)果數(shù)種子數(shù)備注                  3根據(jù)雜交過(guò)程中遇到的問(wèn)題，你認(rèn)為影響雜交結(jié)果的因素有哪些？ 八、作業(yè)及思考題 有性雜交過(guò)程中如何解決父母本花期不遇問(wèn)題？ 紫鴨子

24、草與美人蕉在雜交技術(shù)上有何不同？ 實(shí)驗(yàn)五、人工誘發(fā)植物多倍體一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體的原理和鑒定多倍體的依據(jù)；學(xué)習(xí)并掌握植物多倍體誘導(dǎo)與鑒定的方法和技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)材料 鳳仙花、矮牽牛、懸鈴木等觀賞植物的種子或幼苗。 三、儀器及藥品 儀器：顯微鏡、電子天平、鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺、目鏡測(cè)微網(wǎng)、培養(yǎng)箱、鑷子、刀片、游標(biāo)卡尺、鋼卷尺、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、量筒、燒杯、容量瓶、滴管等。 藥品：秋水仙素、酒精、蒸餾水、碘、碘化鉀、對(duì)氯二苯、卡諾固定液、卡寶品紅溶液等。 四、實(shí)驗(yàn)原理 目前，人工誘導(dǎo)植物多倍體常用秋水仙素溶液進(jìn)行處理。秋水仙素（ colchicine ）又稱(chēng)秋水仙堿，是

25、從百合科植物秋水仙中提煉出來(lái)的一種植物堿，分子式為 C 22 H 25 O 6 N ，溶于酒精、氯仿和冷水中。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的機(jī)理，在于其抑制細(xì)胞分裂時(shí)微管的聚合過(guò)程，阻止紡錘絲的形成，使已分裂的染色體不能遷向細(xì)胞的兩極，細(xì)胞中間也不形成新的核膜，從而形成一個(gè)核內(nèi)染色體加倍的細(xì)胞；加倍細(xì)胞繼續(xù)分裂便形成多倍體的組織器官，進(jìn)而發(fā)育成為多倍體植株。 隨著植物染色體倍性的變化，其形態(tài)和特性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。與二倍體相比，多倍體植株常表現(xiàn)葉片寬厚、表面粗糙、葉柄粗短，莖粗枝少，氣孔數(shù)目減少、保衛(wèi)細(xì)胞變大，葉綠素增加；花、果實(shí)、種子等器官較大、花瓣較多、花色濃艷，花粉量減少、花粉粒增大、花粉育性降

26、低，開(kāi)花和結(jié)實(shí)期延遲等。因此，除準(zhǔn)確地進(jìn)行花粉母細(xì)胞或根尖分生組織細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)外，也可根據(jù)形態(tài)特征和生長(zhǎng)特性對(duì)多倍體進(jìn)行間接的鑒定。 五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1 多倍體的誘導(dǎo) 1 ）秋水仙素溶液的配制： 稱(chēng)取 1g 秋水仙素粉末，先溶于少量酒精中，然后加冷水定容至 100ml ，配成 1 質(zhì)量濃度的母液，裝于棕色瓶?jī)?nèi)， 1 4 冰箱保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)再稀釋成所需要的濃度。 2 ）秋水仙素處理 ：常用浸漬法、滴液法、涂抹法、注射法、離體法等?？筛鶕?jù)處理的組織器官采用其中的一種。 浸漬法：可浸漬幼苗、新梢、腋芽、插條、接穗、種子等。對(duì)種子進(jìn)行處理時(shí)，先用清水浸種（發(fā)芽慢的種子應(yīng)催芽），使種子處于萌動(dòng)

27、狀態(tài)；然后用 0.1% 0.5% 的秋水仙素溶液浸泡種子，一般處理 24h 左右；浸泡后用清水洗凈，略陰干后播種，為了促進(jìn)生根，可在處理液中加入適量的生長(zhǎng)素。 滴液法：對(duì)幼苗進(jìn)行處理，待子葉展開(kāi)時(shí)，將 0.1% 0.5% 的秋水仙素溶液滴在生長(zhǎng)點(diǎn)上，每天早中晚各滴一次，連續(xù)處理 2 3d 。為使藥液不會(huì)很快蒸發(fā)，提高處理效果，可在幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)處放一脫脂棉球，將秋水仙素溶液滴在棉球上。如天氣干燥、蒸發(fā)快，中途可滴加蒸餾水保持藥液濃度；處理結(jié)束后，用清水沖洗數(shù)次，將植株上殘存藥液充分洗凈，注意加強(qiáng)管理，并經(jīng)常觀察記載。 涂抹法：用羊毛脂、瓊脂或甘油將秋水仙素按一定濃度配成乳劑，涂抹在幼苗或枝條的頂端

28、，處理時(shí)間 24 48h ；處理部位要適當(dāng)遮蓋，以減少蒸發(fā)和避免雨水淋洗。 注射法：采用微量注射器將一定濃度的秋水仙素溶液注入植株的頂芽或側(cè)芽中。 離體法：在組織培養(yǎng)過(guò)程中，將適量的秋水仙素加入培養(yǎng)基，經(jīng)短期培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)入無(wú)秋水仙素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，便可獲得多倍體。此法誘變率高，易得到同質(zhì)純合的多倍體。 2 多倍體的鑒定 一般采取先間接鑒定，再直接鑒定的方法。 1 ）間接鑒定法 常采用的鑒定方法有 3 種。 外部形態(tài)鑒定：觀察四倍體與二倍體幼苗，從葉片厚度、顏色深淺、植株生長(zhǎng)強(qiáng)弱等方面加以區(qū)別。一般多倍體表現(xiàn)為莖粗壯，葉厚而皺，葉色變深，生長(zhǎng)速度減慢，花器變大等。 氣孔鑒定：借助刀片和鑷子撕

29、取一小塊葉片下表皮（應(yīng)呈透明薄膜狀），置于載玻片上，滴一滴蒸餾水或 I 2 -KI 溶液，加上蓋玻片，在顯微鏡下觀察氣孔的密度，并用目鏡測(cè)微尺測(cè)量氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng) 度 × 寬度 ；統(tǒng)計(jì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目。測(cè)定 50 個(gè)氣孔的大小及其保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目，計(jì)算平均值。多倍體的氣孔一般比二倍體長(zhǎng)，單位面積氣孔數(shù)比二倍體少，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目比二倍體多。 測(cè)量氣孔長(zhǎng)度的方法：先求目鏡測(cè)微尺每小格的長(zhǎng)度換算值。在顯微鏡下看準(zhǔn)目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺前后兩個(gè)完全重疊的刻度，數(shù)出雙方兩個(gè)重疊刻度間所包括的小格數(shù)目，依下式將目鏡測(cè)微尺每小格換算為實(shí)際長(zhǎng)度微米（ ）。 目鏡測(cè)微尺每小格長(zhǎng)度

30、（ ）鏡臺(tái)測(cè)微尺小格數(shù)×每小格的長(zhǎng)度（ ） / 目鏡測(cè)微尺小格數(shù)。 用目鏡測(cè)微尺量出氣孔長(zhǎng)、寬的格數(shù)，乘以換算值即得實(shí)際長(zhǎng)度（ ）。當(dāng)變換顯微鏡的目鏡、物鏡的放大倍數(shù)時(shí)，須重新調(diào)整換算值；不同的顯微鏡，即使用同樣的放大倍數(shù)觀察，也必須分別測(cè)算其換算值，不能彼此代用。 氣孔的密度用目鏡測(cè)微網(wǎng)測(cè)量，計(jì)算單位面積氣孔的數(shù)目。 花粉粒鑒定：將四倍體與二倍體的新鮮花粉撒于載玻片上，于顯微鏡下觀察花粉的形態(tài)和大?。粶y(cè)定 100 個(gè)花粉粒的直徑，計(jì)算其平均值。多倍體產(chǎn)生的花粉一般比二倍體大。 通過(guò)以上間接方法，初步鑒定出多倍體的可能植株，進(jìn)一步進(jìn)行直接鑒定。 2) 直接鑒定法 直接用誘變植株的根尖

31、細(xì)胞或花粉母細(xì)胞制片染色，在顯微鏡下檢測(cè)染色體的數(shù)目是否真正加倍。 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 統(tǒng)計(jì)不同藥液濃度、不同處理方法及不同處理時(shí)間處理后多倍體植株的誘導(dǎo)率。 供試材料藥液濃度處理方法處理時(shí)間處理試材數(shù)變異株數(shù)誘變率備注        2觀察變異植株（四倍體）與對(duì)照植株（二倍體）的形態(tài)特征，將觀測(cè)結(jié)果填入下表： 供試材料染色體數(shù)目葉片形態(tài)氣孔密度氣孔(長(zhǎng)×寬)保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)花粉粒直徑備注二倍體（2X）       四倍體（4X）

32、0;      七、作業(yè)及思考題 說(shuō)明四倍體與二倍體懸鈴木葉片形態(tài)及氣孔的區(qū)別？解釋造成這種不同的原因？ 你認(rèn)為利用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的技術(shù)要點(diǎn)有哪些？ 實(shí)驗(yàn)六、植物培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉植物培養(yǎng)基的基本成分及其作用，掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法及操作要求，掌握培養(yǎng)基與接種用品的滅菌原理及高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基主要為離體培養(yǎng)植物材料的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)劑物質(zhì)，通常分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基兩個(gè)水平。前者包括大量元素（無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素）、微量元素、有機(jī)附加物（維生素、氨基酸等）、糖和水，固體培養(yǎng)基

33、還需加入凝固劑如瓊脂；完全培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的試驗(yàn)材料和目的，添加一定濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如 BA 、 NAA 等以及成分復(fù)雜的有機(jī)附加物如椰子汁、水解酪蛋白等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的 pH 值。不同種植物的離體培養(yǎng)，甚至同種植物不同器官或組織的培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基的要求可能有些不同。園林植物離體培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基主要有 MS 、 N6 、 B5 、 Nitsch 、 White 、 WPM 等。 瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加入瓊脂制成的培養(yǎng)基在 98 100 下融化，于 45 以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性會(huì)降低。 植物培養(yǎng)基含有豐富而全面的

34、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能供養(yǎng)很多細(xì)菌、真菌等微生物的生長(zhǎng)。因此，任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成便需及時(shí)徹底滅菌，以備培養(yǎng)之用；接種時(shí)使用的所有用品如濾紙、水等也要進(jìn)行滅菌。一般采用高壓蒸汽滅菌，于高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行，在 1.1 kg/cm 2 、 121 的條件下消毒 20 25min 。 三、主要儀器及試材 1儀器用具 電子天平、稱(chēng)量紙、牛角匙、精密 pH 試紙、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、玻璃棒、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、封口膜、電爐或微波爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋等。 2藥品試劑 大量元素（NH 4 NO 3 、KNO 3 、MgSO 4 ·7H 2 O、KH 2 PO 4、CaCl 2 ·2H

35、2 O ）、微量元素（KI 、H3 BO 3、MnSO 4 ·4H 2 O 、ZnSO 4 ·7H 2 O 、Na 2 MoO 4 2H 2 O、CuSO 4 5H 2O 、 CoCl 2 ·6H 2 O ）、有機(jī)成分（肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸）、FeSO 4 ·7H2 O、Na 2 EDTA·2H 2 O、瓊脂、蔗糖、 0.5M NaOH 、BA 、NAA 等。 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1培養(yǎng)基母液的配制以 MS 培養(yǎng)基為例 MS 培養(yǎng)基含有近 20 種營(yíng)養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)這些成分單獨(dú)進(jìn)行稱(chēng)量，可將培養(yǎng)基中的各

36、類(lèi)成分，分別按原用量的 20 倍或 200 倍配成濃縮液，即培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時(shí)，取其總量的 1/20 （ 50 ml ）或 1/200 （ 5 ml ），便可配成培養(yǎng)液（基）。 1）大量元素母液（ 20 ×）：分別稱(chēng)取 33g NH 4 NO 3 、38g KNO 3 、7.4g MgSO 4 7H 2 O 和3.4g KH 2 PO4，裝入500ml 燒杯中，加入適量蒸餾水將其充分溶解；另稱(chēng)取8.8g CaCl 2·2H2O，單獨(dú)溶于 200ml 蒸餾水。然后將二者混合，定容至1 L ，充分混勻后于 4 條件下貯存?zhèn)溆茫ㄏ峦?2）微量元素母液（ 200 

37、15;）：分別稱(chēng)取 4.46g MnSO 4 ·4H 2 O 、 1.72g ZnSO 4 ·7H 2 O 、 1.24g H 3 BO 3 、166mg KI 、50mg Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、5mg CuSO 4 ·5H 2 O、5mg CoCl 2 ·6H 2 O ，加蒸餾水溶解后，定容至 1L 。 3）有機(jī)成分母液（ 200 ×）：分別稱(chēng)取 10g 肌醇、 50mg 煙酸、 50mg 鹽酸吡哆醇、 50mg 鹽酸硫胺素、 200mg 甘氨酸，加水溶解后，定容至 500ml 。 4）鐵鹽母液（ 200 

38、5;）：稱(chēng)取 5.56g FeSO 4 ·7H 2 O 和 7.46g Na 2 EDTA·2H 2 O ，分別溶于 450ml 蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解，然后將兩種溶液混合，于 80 水浴中充分熬合（ 30min ），最后定容到 1 L ，保存于棕色容量瓶中。 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液：稱(chēng)取 50mg 或 100mg 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如 BA 、 NAA 、 IBA 等）粉末，置于 100ml 容量瓶，生長(zhǎng)素類(lèi)先用少量酒精溶解，細(xì)胞分裂素類(lèi)先用少量 0.5M NaOH 溶解，然后以蒸餾水定容至刻度，即配成 0.5 或 1.0 mg/ml 的母液。 2培養(yǎng)基的配制 以配制

39、 1 L MS BA 1.0mg/L NAA 0.5mg/L 固體培養(yǎng)基為例，基本操作過(guò)程如下： 1）稱(chēng)取 30g 蔗糖和 7g 瓊脂，裝入 1 L 的容器（如燒杯）中，加入約 700ml 蒸餾水，置于帶石棉網(wǎng)的電爐上或微波爐中加熱，并用玻棒攪拌，至瓊脂完全溶化。 2）用量筒或移液管分別取 50ml 大量元素母液、 5ml 微量元素母液、 5ml 有機(jī)成分母液和 5ml 鐵鹽母液，加入上述容器中。 3）分別用 1ml 移液管吸取 1ml BA 母液（ 1.0mg/ml ）和 0.5ml NAA 母液（ 1.0mg/ml ），加入培養(yǎng)基中，然后加蒸餾水將總體積定到 1000ml 。 4）以 0.

40、5M NaOH 溶液將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)至 5.8 6.0 ，混勻后分裝于培養(yǎng)容器中，每瓶裝入約 30ml 培養(yǎng)基，然后用聚乙烯膜封口。如果采用培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，配制好的培養(yǎng)基可先裝入三角瓶，滅菌后（培養(yǎng)皿同時(shí)滅菌）于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行分裝。 3滅菌 將培養(yǎng)基、無(wú)菌水、濾紙、器皿等放入高壓滅菌鍋內(nèi)，于 1.01kg/cm 2 壓力、 121 條件下滅菌 20min 。滅菌完畢后，將培養(yǎng)基取出（其他滅菌材料一并取出），水平放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，待其冷卻凝固后便可用于接種培養(yǎng)。 具體操作按滅菌鍋的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，包括加水、裝鍋、蓋蓋、加熱、排放冷空氣、升壓保溫、降壓排氣、出鍋冷卻等步驟。 徹底滅菌后的培養(yǎng)基可于

41、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存一段時(shí)間，但最好盡快使用。 五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1配制培養(yǎng)基母液的濃度應(yīng)根據(jù)實(shí)際使用情況確定，最好能使母液在 1 2 個(gè)月內(nèi)用完，其中有機(jī)成分要在 4 冰箱內(nèi)保存。大量元素母液的配制過(guò)程中， CaCl 2 必須單獨(dú)溶解，然后再與其他成分的溶液混合，否則溶液中易出現(xiàn)沉淀；配制鐵鹽母液時(shí)，兩種成分應(yīng)單獨(dú)溶解后再于 80 左右充分熬合，避免發(fā)生結(jié)晶沉淀。 2配制培養(yǎng)基的所用器皿和用具均應(yīng)洗滌干凈，培養(yǎng)基的 pH 值應(yīng)調(diào)整準(zhǔn)確，滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則培養(yǎng)基可能會(huì)出現(xiàn)不凝固現(xiàn)象。 3培養(yǎng)基配制后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行滅菌，如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，最好放入冰箱內(nèi)暫存。 4高壓滅菌鍋的使用應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，尤其注意檢查鍋內(nèi)水位，防治干燒導(dǎo)致電熱管損壞。 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理 5 6 人為一組，每組按要求配制一種培養(yǎng)基，分裝滅