分光光度法檢測標準操作規(guī)程

1、文件名稱紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程文件編碼SW10-04-002-00SW10-04-002-00頁數(shù)第1 1頁共9 9頁制定人制定日期年月日頒發(fā)部門質量管理部審核人審核日期年月日批準人批準日期年月日生效日期年月日分發(fā)部門質量管理部紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程1目的建立紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程，保證正確操作。2范圍適用本公司紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程。3責任質量管理部4內容4.1引用標準中華人民共和國藥典（2015年版）四部4.2概述4.2.1紫外分光光度法是通過被測物質在紫外光區(qū)的特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法，本法在藥品檢驗中主要用于

2、藥品的鑒別、檢查和含量測定。4.3定量分析通常選擇在物質的最大吸收波長處測出吸收度， 然后用對照品或百分吸收系數(shù)求算出被測物質的含量，多用于制劑的含量測定。4.3.1對已知物質定性可用吸收峰波長或吸收度比值作為鑒別方法；若化合物本身在紫外光區(qū)無吸收，而雜質在紫外光區(qū)有相當強度的吸收，或在雜質的吸收峰處化合物無吸收，則可用本法作雜質檢查。4.3.2原理物質對紫外輻射的吸收，是由于分子中原子的外層電子躍遷所產生的，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結構，故紫外光譜又稱電子光譜。有機化合物分子結構中如含有共腕體系、 芳香環(huán)或發(fā)色基團， 均可在近紫外區(qū)(200-400nm)或可見光區(qū)(400-850n

3、m)產生吸收。 通常使用的紫外分光光度計的工作波長范圍為190900nm因此又稱紫外一可見分光光度計。紫外吸收光譜為物質對紫外區(qū)輻射的能量吸收圖。朗伯比耳(lambert-Beer)定律為光的吸收定律， 它是紫外分光光度法定量分析的依據(jù)， 其數(shù)學表達式為：A=lg=ECLT式中：A為吸收度T為透光率E為吸收系數(shù)C為溶液濃度L為光路長度若溶液的濃度(C)為1%(g/ml),光路長度(L)為1cm,相應的吸收系數(shù)為百分吸收系數(shù)， 以Ej2表示。若溶液的濃度(C)為摩爾濃度(mol/L),光路長度為1cm時，則相應吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以e來表示。4.4儀器：4.4.1紫外分光光度計主要由光源、單

4、色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。4.4.2為了滿足紫外一可見光區(qū)全波長范圍的測定，儀器備有二種光源，即笊燈和碘鴇燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見光區(qū)。4.4.3單色器通常由進光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件、聚焦透鏡或反射鏡等組成，色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對200400nm波長光的色散能力很強，對600nm以上波長的光色散能力較差，棱鏡色散所得的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達到色散作用，故常稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長作線性排列，故為勻排光譜，雙光束儀器多用光柵為色散元件。4.4.4檢測器有光電管和光電

5、倍增管二種。4.4.5紫外分光光度計依據(jù)其結構和測量操作方式的不同，可分為單光束和雙光束分光光度計二類。單光束分光光度計有些仍為手工操作，即固定在某一波長，分別測量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度， 操作比較費時， 用于繪制吸收光譜圖時很不方便， 但適用于單波長的含量測定。雙光束分光光度計扇形鏡交替切換光路，使光分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達檢測器，檢測器信號經(jīng)調制分離成兩光路對應信號，信號的比值直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計操作簡單，測量快速，自動化程度高，但作含量測定時，為求準確起見，仍宜用固定波長測量方式。4.5紫外分光光度計的檢定：4.5.1波長準確度：4.5.2

6、波長準確度的允差范圍雙光束光柵型紫外一可見分光光度計波長準確度允許誤差為0.5nm。單光束棱鏡型350nmM0.7nm,500nmM2.0nm,700nmM4.8nm。4.5.3波長準確度檢定方法4.5.4用低壓汞燈檢定，關閉光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對準進光狹縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測定方式，采用波長掃描方式，掃描速度“慢”（如15nm/min）,響應“快”，最小狹縫寬度（如0.1nm）量程0100%在200800nm范圍內單方向重復掃描3次，由儀器識別記錄各峰值（若儀器無“峰檢測”功能，必要時可對指定波長進行“單峰”掃描）。單光束儀器以751G型為例，可將選擇開關放在X0

7、.1位置，透光率讀數(shù)放在100（或選擇開關放在X1,透光率放在10）,關小狹縫，打開光閘門，緩緩轉動波長盤，尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長讀數(shù)不符，應調節(jié)儀器左側準直鏡的波長調整螺絲。如波長向短波長方向移動，應順時針方向旋轉波長調整螺絲，如向長波長方向移動，則應反時針方向旋轉波長調整螺絲，調整好后，再按汞燈的下列譜線測試，記錄每條譜線與儀器波長讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外一可見分光光度計的汞燈譜線波長：237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、2、365.48、366.33、404.66（紫色）、435.83（藍色）、546.

8、07（綠色）、576.96（黃色）、579.07nm。用儀器固有的笊燈檢定：本法主要用于日常工作中波長準確度的核對，取單光束能量測定方式，測量條件同上述低壓汞燈的方法，對486.02及656.10nm二單峰進行單方向重復掃描3次。用氧化欽玻璃檢定：將氧化欽玻璃放入樣品光路，參比光路為空氣，按測定吸收光譜圖方法測定。校正自動記錄儀器時，應考慮記錄儀的時間常數(shù)，測定樣品與校正時取同一掃描速度。氧化欽玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2、637.5nm波長處有尖銳的吸收峰，可供波長檢定用。氧化欽玻璃因制造的原因，每片氧化欽的吸收峰波長有

9、差異，應使用經(jīng)計量部門校驗過的。用高氯酸欽溶液檢定：本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計波長準確度檢定用。高氯酸欽溶液的配制方法：取10%（氯酸為溶劑，加入氧化欽（HOQ）,配成4%液即得。 高氯酸欽溶液較強的吸收峰波長為241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的，記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實波長，為了準確測定，建議采用定點檢定而不用掃描方式。吸收度準確度：精密稱取在120c干燥至恒重的基準重銘酸鉀約60mg置1000ml

10、量瓶中，用硫酸液（0.005mol/L）溶解并稀釋至1000ml,用配對的1cm石英池，以硫酸液（0.005mol/L）為空白，在235、257、313、350nm分別測定吸收度，然后換算成E1%，測得值應符合下表中規(guī)定的允差范圍（1%。國際藥典規(guī)定的允差亦為土1%分光光度法允差范圍波長（nmj）吸收度強度吸收系數(shù)（E/4）允差范圍235最小124.5123.3125.7257最大144.0142.6145.4313最小48.6248.1349.11350最大106.6105.5107.7分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項檢定，按中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程JJG682-90雙

11、光束紫外可見分光光度計檢定規(guī)程執(zhí)行，并符合有關項下的規(guī)定。日常常規(guī)測定主要是對以上兩項時常檢查。樣品測定操作方法：吸收系數(shù)測定（性狀項下）：按各該品種項下規(guī)定的方法，配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測吸收度，并計算吸收系數(shù)，應符合規(guī)定范圍。鑒別及檢查：按各該品種項下規(guī)定的方法，測定供試品溶液在有關波長處的最大及最小吸收，有的并須測定其各最大吸收峰值，或最大吸收與最小吸收的比值，均應符合規(guī)定。含量測定對照比較法：按各該品種項下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分標示量的（10010）%以內,用同一溶劑，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品

12、溶液的吸收度。吸收系數(shù)法：按各該品種項下配制供試品溶液，在規(guī)定波長及該波長1nm處測定其吸收度，按各該品種規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計算含量。采用吸收系數(shù)法，應對儀器進行校正后測定，如測定新品種的吸收系數(shù)，需按“吸收系數(shù)測定法”規(guī)定進行。計算分光光度法：采用該法的品種，應嚴格按該品種項下規(guī)定的方法進行，用本法時應注意：有一些吸收度是在供試品或其成分吸收曲線的上升或下降陡坡部測定， 影響精度的因素較多， 故應仔細操作，盡量使測定供試品和對照品的條件一致；若該品種不用對照品，則應在測定前對儀器作仔細的校正和檢定。注意事項：試驗中所用的量瓶、移液管均應經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。使用的石英吸收池必須潔凈。

13、用于盛裝樣品、參比及空白溶液的吸收池，當裝入同一溶劑時，在規(guī)定波長處測定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對使用，否則必須加以校正。取吸收池時，手指拿毛玻璃面的兩側。裝盛樣品溶液，以池體積的4/5為宜，測定揮發(fā)性溶液時應加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應無殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質殘留在池子的透光面，可先用醮有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時應注意每次放入方向相同。使用后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存。吸收池如污染不易洗凈時，可用硫酸，發(fā)煙硝酸（3:1V/V）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用銘酸鉀清潔液清洗時，吸收池不宜在清潔液中長

14、時間浸泡，否則清潔液中的銘酸鉀結晶會損壞吸收池的光學表面，并應充分用水沖洗，以防銘酸鉀吸附于吸收池表面。測定前應先檢查所用的溶劑在測定供試品所用的波長附近是否符合要求，可用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白，測定其吸收度，應符合下表規(guī)定。以空氣為空白測定溶劑在不同波長處的吸收度的規(guī)定波長范圍（nm220240241250251300300以上吸收度0.40.20.10.05每次測定時應采用同一廠牌批號，混合均勻的一批溶劑。稱量應按藥典規(guī)定要求。配制測定溶液時，稀釋轉移次數(shù)應盡可能少；轉移稀釋時，所取容積一般應不少于5ml。含量測定供試品應取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應稱取2份。吸收

15、系數(shù)檢查也應稱取供試品2份，平行操作，每份結果對平均值的偏差應在土0.5%以內。作鑒別或檢查可取樣品1份供試品測試液的濃度，除各該品種項下已有注明外，供試品溶液的吸收度以在0.3-0.7之間為宜，吸收度在此范圍誤差較小，并應結合所用儀器吸收度線性范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。選用儀器的狹縫寬度應小于供試品的吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度會偏低，狹縫寬度的選擇應以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準，對于中國藥典紫外測定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但對某些品種如青霉素鉀及鈉的吸收度檢查則用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸收度會偏低。測定時除另有規(guī)定外，應在規(guī)定的吸收峰土2nm處，再

16、測幾點的吸收度，以核對供試品的吸收峰位置是否正確， 并以吸收度最大的波長作為測定波長。 除另有規(guī)定外吸收度最大波長應在該品種項下規(guī)定的波長土1nm以內，否則應考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的準確度。結果計算對照品比較法：可根據(jù)供試品溶液及對照品溶液的吸收度與對照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計算含量。A樣：A又=C樣：C對C寺釬 A寺4A對XC對式中：A為吸收度值；C為測試液濃度（以mg/ml計）。吸收系數(shù)法：中國藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指E11即在指定波長時，光路長度為1cm,試樣濃度換算為1%（g/ml）時的吸收度值，故應先求出被測樣品的E1%值比較,可計算出供試樣品的含量

17、。oAE1cm1cm（樣品）=CXL式中：A為供試品溶液測得的吸收度值；C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質的克數(shù)；L為吸收池的光路長度（cm）;L1%E（樣品）供試品的含量%=一二X100%匚1%Ecm（標準）式中：EJ時（樣品）為根據(jù)前式計算出的供試品的百分吸收系數(shù)；EJ（標準）為藥典或標準中規(guī)定的百分吸收系數(shù)。吸收系數(shù)測定法：本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測定。測定方法：取精制樣品，精密稱取一定量，使樣品溶液配成吸收度讀數(shù)在0.60.8之間，置1cm吸收池中，在規(guī)定波長處按5.6.8.項的規(guī)定測出讀數(shù)，然后再用同批溶劑將其稀釋1倍，使吸收度在0.30.4之間，再按上述方法測定。樣品應同時測定2份，同一臺儀器測定的2份間相對誤差應不超過土0.5%,否則應重測。 測定時先按儀器正常靈敏度測試， 然后再減小狹縫測定，直到減小狹縫吸收度值不增加為止，取吸收度不改變的數(shù)據(jù)。再用4臺不同型號的儀器復測。吸收系數(shù)可根據(jù)比耳一朗伯定律求算，以下例說明：已知某化合物的分子量為287,用乙醇配成濃度為0.0030%的溶液，在波長297