常見化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)比較

1、常見化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)比較1、化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA,英音:,kemi,lju:minesns,imju:nusei是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合,用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)。CLIA是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合,用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、

2、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)。1.1、化學(xué)發(fā)光免疫分析原理化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí),同時(shí)發(fā)射出光子(hv,利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析上,或酶作用于發(fā)光底物。1.2、化學(xué)發(fā)光免疫分析類型化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種:(1化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法;(2酶標(biāo)記、以化學(xué)

3、發(fā)光底物作信號(hào)試劑的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法1.2.1化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CL IA,是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物-acridiniumester(AE,是有效的發(fā)光標(biāo)記物,其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-H2O2作用而發(fā)光,強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成,為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析,其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑;檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法,大分子抗原則采用夾心法,非特異性結(jié)合少,本底低;與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量,從而增加靈敏度。1.2.2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析從標(biāo)記免疫分

4、析角度,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA,應(yīng)屬酶免疫分析,只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑,操作步驟與酶免分析完全相同:以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號(hào)試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP和堿性磷酸酶(AL P,它們有各自的發(fā)光底物。12.2.1HRP標(biāo)記的CLEIA常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼,luminol,或其衍生物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰肼,是一類重要的發(fā)光試劑。其結(jié)構(gòu)如圖4所示。魯米諾的氧

5、化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行,在過(guò)氧化物酶及活性氧過(guò)氧化陰離子(O2-,單線態(tài)氧(1O2,羥自由基(OH,過(guò)氧化氫(H2O2存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體,當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光,其波長(zhǎng)為425nm。早期用魯米諾直接標(biāo)記抗原(或抗體,但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使靈敏度受到影響。近來(lái)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體,進(jìn)行免疫反應(yīng)后利用魯米諾作為發(fā)光底物,在過(guò)氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(N aOH-H2O2作用下,魯米諾發(fā)光,發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。Kodak AmerliteTM半自動(dòng)分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設(shè)計(jì)的。1.2.2.2增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme im

6、munoassay,ELEIA在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑,如對(duì)2碘苯酚等,以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào),并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定,便于重復(fù)測(cè)量,從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。在全自動(dòng)分析儀上,還可通過(guò)計(jì)算機(jī)嚴(yán)密控制,進(jìn)行自動(dòng)操作,如加試劑,混合,溫育,洗滌,加發(fā)光試劑,發(fā)光計(jì)數(shù),數(shù)據(jù)處理,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,直至完成病人血清樣品的分析并打印出結(jié)果。Am erliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強(qiáng)劑,其發(fā)光時(shí)間可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)20min,試劑盒有甲狀腺功能檢測(cè)的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪

7、酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。1.2.2.3ALP標(biāo)記的CLEIA所用發(fā)光底物為環(huán)1,2-二氧乙烷衍生物,用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的金剛烷基,其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán),在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常使用的底物AMPPD3-2-spiroadamatane-4-methoxy -4-3-phosphoryloxy-phenyl-1,2-dioxetaneDioxetane中文名為:3-(2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷。在堿性磷酸酶(ALP作用下,磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個(gè)磷酸基,

8、得到一個(gè)中等穩(wěn)定的中間體AMPD(半壽期為2-30min,此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子,當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生470nm的光,可持續(xù)幾十分鐘(如圖5。AMPPD為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物,可用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結(jié)合物?？蓹z測(cè)到堿性磷酸酯酶的濃度為10-15mol/L。美國(guó)DPC公司的Immulite全自動(dòng)酶放大發(fā)光免疫分析儀,以堿性磷酸酶為標(biāo)記物,以金剛烷作發(fā)光底物,測(cè)定靈敏度相當(dāng)于10-21mol/mL的酶,采用聚苯乙烯珠作載體,其檢測(cè)水平已能達(dá)到10-12g/mL。AMPPD是一種生物化學(xué)領(lǐng)域中最新的超

9、靈敏的堿性磷酸酶底物,其特點(diǎn):反應(yīng)速度快,在很短時(shí)間內(nèi)提供正確可靠的結(jié)果。在它的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)重要部分,一個(gè)是聯(lián)接苯環(huán)和金剛烷的二氧四節(jié)環(huán),它可以斷裂并發(fā)射光子;另一個(gè)是磷酸根基團(tuán),它維持著整個(gè)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在通常情況下,這種化合物很穩(wěn)定。但是當(dāng)有堿性磷酸酶存在時(shí),DioxetanePhosphate作為酶的底物會(huì)在酶的催化一脫去磷酸根基團(tuán),形成一個(gè)不穩(wěn)定的中間體。這個(gè)中間體隨即自行分解(二氧四節(jié)環(huán)斷裂,同時(shí)發(fā)射光子。該試劑采用微粒子化學(xué)發(fā)光技術(shù),采用最新磁性微粒,用以包被抗體。用堿性磷酸酶(ALP標(biāo)記抗原(抗體。經(jīng)過(guò)普通抗原抗體反應(yīng),堿性磷酸酶結(jié)合在微粒子上,堿性磷酸酶的結(jié)合量同病人血清

10、中的待測(cè)物質(zhì)成比例。經(jīng)過(guò)洗滌(反應(yīng)管兩邊有磁場(chǎng),磁性微粒包被的抗原抗體結(jié)合物被吸附在管子兩邊,其余游離部分被抽吸掉,最后加入發(fā)光底物DioxetanePhosphate,5分鐘后,儀器通過(guò)光電倍增管檢測(cè)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。AMPPD是堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物,在適宜的緩沖液中,隨著酶的催化水解作用,AMPPD分解成AMP-D,后者發(fā)出強(qiáng)度很高的光信號(hào),其發(fā)光的速度取決于堿磷酶的濃度。當(dāng)堿磷酶偶合到雜交的探針時(shí),便可以通過(guò)此系統(tǒng)檢測(cè)到雜交分子的存在量。2微粒體發(fā)光免疫分析微粒體發(fā)光免疫分析(microparticle luminescence enzyme immunoassay,MLEIA,該免疫

11、分析技術(shù)有兩種方法:一種是小分子抗原物質(zhì)的測(cè)定采用競(jìng)爭(zhēng)法。另一種是大分子的抗原物質(zhì)測(cè)定采用雙抗體夾心法。該儀器所用固相磁粉顆粒極微小,其直徑僅1.0m,這樣大大增加了包被表面積,增加抗原或抗體的吸附量,使反應(yīng)速度加快,也使清洗和分離更簡(jiǎn)便,從而減少污染,降低交叉污染概率。反應(yīng)中使用堿性磷酸酶(ALP標(biāo)記抗原或抗體,作用于其底物二氧乙烷磷酸酯,由其在激發(fā)態(tài)與基態(tài)的動(dòng)力學(xué)變化中發(fā)生發(fā)光反應(yīng)。2.1、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)其原理是:用過(guò)量包被磁顆粒的抗體,與待測(cè)的抗原和定量的標(biāo)記吖啶酯抗原同時(shí)加入反應(yīng)杯溫育,其免疫反應(yīng)的結(jié)合形式有兩種,一是標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物;二是測(cè)定抗原與抗體的結(jié)合形式。如受檢標(biāo)本中含有

12、待測(cè)抗原,則與標(biāo)記抗原以同樣的機(jī)會(huì)與磁顆粒包被的抗體結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性地占去了吖啶酯標(biāo)記抗原與磁顆粒包被的抗體結(jié)合的機(jī)會(huì),使吖啶酯標(biāo)記抗原與磁顆粒包被的抗體的結(jié)合量減少。由于磁顆粒包被的抗體是過(guò)量的,足以與待測(cè)抗原結(jié)合。2.2、雙抗體夾心法:其原理是:標(biāo)記抗體與被測(cè)抗原同時(shí)與包被抗體結(jié)合成一種反應(yīng)形式,即包被抗體-測(cè)定抗原-發(fā)光抗體的復(fù)合物。具體講是以順磁性微珠作為載體包被抗體,利用磁性微珠能被磁場(chǎng)吸引,在磁場(chǎng)的作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)的特性,迅速捕捉到被測(cè)抗原,當(dāng)加入標(biāo)本后,標(biāo)本中的抗原與磁性抗體形成復(fù)合物,在磁力的作用下,協(xié)助該復(fù)合物快速地與其他非特異性物質(zhì)分離,使抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間縮短,測(cè)定時(shí)

13、間減少,降低了交叉污染的幾率,此時(shí)再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體,形成磁珠包被抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物,經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合的抗體后,加入ALP的發(fā)光底物環(huán)1,2-二氧乙烷衍生物AMPPD。AMPPD被復(fù)合物上ALP催化,迅速地去磷酸基團(tuán),生成不穩(wěn)定的中間體AMPD。AMPD的快速分解,從高能激發(fā)態(tài)回到低能量的穩(wěn)定態(tài)時(shí),持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)射出光子(hv,發(fā)射光所釋放的光子能量被光量子閱讀系統(tǒng)記錄,通過(guò)計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)將光能量強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上轉(zhuǎn)換為待測(cè)抗原的濃度,并報(bào)告結(jié)果。其檢測(cè)水平可達(dá)pg/ml水平,重復(fù)性好。3、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoas

14、say, ECLIAECLIA是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定以后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù),是電化學(xué)發(fā)光(ECL和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物。它的標(biāo)記物的發(fā)光原理與一般的化學(xué)發(fā)光(CLA不同,是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng),實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過(guò)程。ECL與CLA的差異在于ECLA 是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng),而CLA是通過(guò)化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。ECLA 不僅可以應(yīng)用于所有的免疫測(cè)定,而且還可用于DNA/RNA探針檢測(cè)。其檢測(cè)原理(以TSH檢測(cè)為例:第一步:結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即Ru(bpy32+N羥基琥珀酰胺酯(NHS的TSH抗體和結(jié)合了生物素的TSH

15、抗體與待測(cè)血清同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育9分鐘。第二步:將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中,再次孵育9分鐘,使生物素通過(guò)與親和素的結(jié)合將磁珠、TSH抗體連接為一體,形成雙抗體夾心法。下一步,蠕動(dòng)泵將形成的Ru(bpy32+-抗體-抗原-抗體-磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測(cè)量室,此時(shí),磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時(shí),游離的TSH抗體(與生物素結(jié)合的和與Ru(bpy32+結(jié)合的抗體也被吸出測(cè)量室。緊接著,蠕動(dòng)泵加入含三丙胺(TPA的緩沖液,同時(shí)電極加電壓,啟動(dòng)ECL反應(yīng)過(guò)程。發(fā)光劑Ru(bpy32+和電子供體TPA在陽(yáng)極表面可同時(shí)各失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng),使二價(jià)的Ru(bpy32+被氧化成

16、三價(jià),后者是一種強(qiáng)氧化劑;另一方面,TPA被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+,后者很不穩(wěn)定,可自發(fā)失去一個(gè)質(zhì)子(H+,形成自由基TPA,這是一種很強(qiáng)的還原劑,可將一個(gè)電子給三價(jià)的Ru(bpy33+,使其形成激發(fā)態(tài)的Ru(bpy32+,而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy32+通過(guò)熒光機(jī)制衰減,發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)620nm的光子,重新生成基態(tài)的Ru(bpy32+。該過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行,產(chǎn)生許多光子,光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度,光強(qiáng)度與Ru(bpy32+的濃度呈線性關(guān)系,故可測(cè)出待測(cè)抗原的含量。最后,終止電壓,移開磁珠,加入清洗液沖洗流動(dòng)測(cè)量室,準(zhǔn)備下一個(gè)樣品測(cè)定。4、時(shí)間分辨熒光免疫

17、分析(timeresolved fluoroimmunoassay,TRFIATRFIA以鑭系元素作為標(biāo)記物所建立的免疫測(cè)定技術(shù)。因鑭系元素(如Eu3+所發(fā)射的熒光壽命長(zhǎng),在測(cè)定特異性熒光時(shí),可通過(guò)延遲檢測(cè)時(shí)間而將標(biāo)本或環(huán)境中的非特異熒光扣除,使其具有良好信噪比。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(TRFIA是一種非同位素免疫分析技術(shù),它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體,根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn),用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光,同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨,可有效地排除非特異熒光的干擾,極大地提高了分析靈敏度。在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光,因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的靈敏度就

18、會(huì)嚴(yán)重下降。大部分背景熒光信號(hào)是短時(shí)存在的,因此將長(zhǎng)衰減壽命的標(biāo)記物與時(shí)間分辨熒光技術(shù)相結(jié)合,就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到最小化。時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA實(shí)際上是在熒光分析(FIA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)波長(zhǎng)的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響,同時(shí),熒光分析與普通分光不同,光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上,激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器,從而大幅度地提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是,當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候,激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此,解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測(cè)量時(shí)

19、沒(méi)有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短,激發(fā)光消失,熒光也消失。不過(guò)有非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy的熒光壽命較長(zhǎng),可達(dá)1 2ms,能夠滿足測(cè)量要求,因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法,即使用長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物,在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。平時(shí)常用的稀土金屬主要是Eu(銪和Tb(鋱,Eu熒光壽命1ms,在水中不穩(wěn)定,但加入增強(qiáng)劑后可以克服;Tb熒光壽命1.6ms,水中穩(wěn)定,但其熒光波長(zhǎng)短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解,因此從測(cè)量方法學(xué)上看Tb很好,但不適合用于生物分析,故Eu最為常用。4.1、時(shí)間分辨信號(hào)原理普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,在選擇熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí),必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間