獸用化學藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導原則

1、獸用化學藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導原則（獸藥研究技術(shù)指導原則之6）來源 中國獸藥監(jiān)察所 中國獸藥信息網(wǎng)編輯 南寧獸藥科技網(wǎng)Dongy 2010-9-51 概 述保證獸藥安全、有效、質(zhì)量可控是獸藥研發(fā)和評價應遵循的基本原則，其中，對獸藥進行質(zhì)量控制是保證獸藥安全有效的基礎(chǔ)和前提。為達到控制質(zhì)量的目的，需要多角度、多層面來控制產(chǎn)品質(zhì)量，也就是說要對藥物進行多個項目測試，來全面考察產(chǎn)品質(zhì)量。一般地，每一測試項目可選用不同的分析方法，為使測試結(jié)果準確、可靠，必須對所采用的分析方法的科學性、準確性和可行性進行驗證，以充分表明分析方法符合測試項目的目的和要求，這就是通常所說的對方法進行驗證。方法驗證

2、的目的是判斷采用的分析方法是否科學、合理，是否能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。從本質(zhì)上講，方法驗證就是根據(jù)檢測項目的要求，預先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容，并通過設(shè)計合理的試驗來驗證所采用的分析方法是否符合檢測項目的要求。方法驗證在分析方法建立過程中具有重要的作用，并成為質(zhì)量研究和質(zhì)量控制的組成部分。只有經(jīng)過驗證的分析方法才能用于控制產(chǎn)品質(zhì)量，因此方法驗證是制訂質(zhì)量標準的基礎(chǔ)。方法驗證是藥物研究過程中的重要內(nèi)容。本指導原則重點探討方法驗證的本質(zhì)，將分析方法驗證的要求與所要達到的目的結(jié)合起來進行系統(tǒng)和規(guī)律性的闡述，重點闡述如何科學合理地進行論證方案的設(shè)計。本指導原則主要包括方法驗證的一般原則、方法驗證涉及的三個

3、主要方面、方法驗證的具體內(nèi)容、對方法驗證的評價等內(nèi)容。2 方法驗證的一般原則原則上每個檢測項目采用的分析方法，均需要進行方法驗證。方法驗證的內(nèi)容應根據(jù)檢測項目的要求，結(jié)合所采用分析方法的特點確定。同一分析方法用于不同的檢測項目會有不同的驗證要求。例如，采用高效液相色譜法用于制劑的鑒別和雜質(zhì)定量試驗應進行不同的方法驗證時，前者重點要求驗證專屬性，而后者重點要求驗證準確性、專屬性、定量限。3 方法驗證的三個主要方面3-1 需要驗證的檢測項目檢測項目是為控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證安全有效而設(shè)定的測試項目。根據(jù)檢測項目的設(shè)定目的和驗證內(nèi)容的不同要求，本指導原則將需驗證的檢測項目分為鑒別、雜質(zhì)檢查（限度試驗、定

4、量試驗）、定量測定（含量測定、溶出度、釋放度等）、其他特定檢測項目等四類。鑒別的目的在于判定被分析物是目標化合物，而非其它物質(zhì)，用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性。雜質(zhì)檢查主要用于控制主成分以外的雜質(zhì)，如有機雜質(zhì)，無機雜質(zhì)等。雜質(zhì)檢查可分為限度試驗和定量試驗兩種情況。限度試驗通常指氯化物、硫酸鹽、重金屬、砷鹽、熾灼殘渣、干燥失重、水分等檢查。定量試驗一般包括有關(guān)物質(zhì)、有機溶劑殘留量等檢查。用于限度試驗的分析方法驗證側(cè)重專屬性和檢測限。用于定量試驗的分析方法驗證強調(diào)專屬性、定量限和準確性。定量測定包括含量測定、制劑的溶出度測定等，由于此類項目對準確性要求較高，故所采用的分析方法要求具有一定的

5、專屬性、準確性和線性。其他特定檢測項目包括粒徑分布、旋光度、分子量分布等，由于這些檢測項目的要求與鑒別、雜質(zhì)檢查、定量測定等有所不同，對于這些項目的分析方法驗證應有不同的要求。3-2 分析方法本指導原則所指分析方法是為完成上述各檢測項目而建立的測試方法，一般包括分析方法原理、儀器及儀器參數(shù)、試劑、系統(tǒng)適用性試驗、供試品溶液制備、對照品溶液制備、測定、計算及測試結(jié)果的報告等。測試方法可采用化學分析方法和儀器分析方法。這些方法各有特點，同一測試方法可用于不同的檢測項目，但驗證內(nèi)容可不相同。3-3 驗證內(nèi)容驗證內(nèi)容包括驗證分析方法的專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、檢測限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用

6、性等。4 方法驗證的具體內(nèi)容4-1 專屬性專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法具備正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性。通常，在鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定方法中均應考察其專屬性。如采用的方法不夠?qū)?，應采用多個方法予以補充。4-1-1 鑒別鑒別試驗應確證被分析物符合其特征，專屬性試驗要求證明能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分，需確證含被分析物的樣品呈正反應（可與已知對照物比較），而不含被測成分的樣品呈負反應，結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物也應呈負反應。4-1-2 雜質(zhì)檢查作為純度檢查，所采用的分析方法應確保可檢出被分析物中雜質(zhì)的含量，如有關(guān)物質(zhì)、重金屬、殘留溶劑等

7、。因此雜質(zhì)檢查要求分析方法有一定的專屬性。在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出，并具適當?shù)臏蚀_度與精密度。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，專屬性可通過與另一種已證明合理但分離或檢測原理不同、或具較強分辨能力的方法進行結(jié)果比較來確定?；?qū)⒐┰嚻酚脧姽庹丈洌邷?，高濕，酸、堿水解及氧化的方法進行破壞（制劑應考慮輔料的影響），比較破壞前后檢出的雜質(zhì)個數(shù)和量。必要時可采用二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進行色譜峰純度檢查。4-1-3 含量測定含量測定目的是得到樣品中被分析物的含量或效價的準確結(jié)果。在雜質(zhì)可獲得的情況下，對于主成分含量測定可在供試品中加入雜質(zhì)

8、或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測定結(jié)果。在雜質(zhì)不能獲得的情況下，可采用另一個經(jīng)驗證了的或中國獸藥典收載的方法進行比較，對比兩種方法測定的結(jié)果。也可采用破壞性試驗（強光照射，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化），得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進行含量測定比較測定結(jié)果。必要時進行色譜峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。4-2 線性線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與試樣中被分析物的濃度（量）直接呈線性關(guān)系的程度。線性是定量測定的基礎(chǔ)，涉及定量測定的項目，如雜質(zhì)定量試驗和含量測定均需要驗證線性。應在設(shè)計的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或

9、分別精密稱樣，制備一系列被測物質(zhì)濃度系列進行測定，至少制備5個濃度。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經(jīng)數(shù)學轉(zhuǎn)換，再進行線性回歸計算，并說明依據(jù)。4-3 范圍范圍系指能夠達到一定的準確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被分析物的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍是規(guī)定值，在試驗研究開始之前確定驗證的范圍和試驗方法。可采用符合要求的原料藥配制成不同的濃度，照相應的測定方法進行試驗。范圍通常用與分析方法的測試結(jié)果相同的單位（如百分濃度）表達。涉及到定量測定的檢測項目均需要對范圍進行驗證，如含量測定、含量均勻度、溶出度或釋放度、雜質(zhì)定量試驗等。范圍應根

10、據(jù)劑型和（或）檢測項目的要求確定。4-3-1 含量測定范圍應為測試濃度的80120。4-3-2 制劑含量均勻度范圍應為測試濃度的70130。根據(jù)劑型特點，范圍可適當放寬。4-3-3 溶出度或釋放度對于溶出度，范圍應為限度的±20；如規(guī)定限度范圍，則應為下限的-20至上限的+20。對于釋放度，如規(guī)定限度范圍，從1 小時后為20至24 小時后為90，則驗證范圍應為0110。4-3-4 雜質(zhì)雜質(zhì)測定時，范圍應根據(jù)初步實測，擬訂出規(guī)定限度的±20。如果含量測定與雜質(zhì)檢查同時測定，用面積歸一化法，則線性范圍應為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20至含量限度（或上限）的+20。4-4準確度準確度系指用

11、該方法測定的結(jié)果與真實值或認可的參考值之間接近的程度。有時也稱真實度。一定的準確度為定量測定的必要條件，因此涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證準確度，如含量測定、雜質(zhì)定量試驗等。準確度應在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。對于制劑一般以回收率試驗來進行驗證。試驗設(shè)計需考慮在規(guī)定范圍內(nèi)，制備3 個不同濃度的樣品，各測定3 次，即測定9 次，報告已知加入量的回收率（）或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其可信限。4-4-1 含量測定原料藥可用已知純度的對照品或符合要求的原料藥進行測定，或用本法所得結(jié)果與已建立準確度的另一方法測定的結(jié)果進行比較。制劑可用含已知量被測物的各組分混合物進行測定。如不能得到制劑的全部組分，可向

12、制劑中加入已知量的被測物進行測定，必要時，與另一個已建立準確度的方法比較結(jié)果。4-4-2 雜質(zhì)定量試驗雜質(zhì)的定量試驗可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進行測定。如果不能得到雜質(zhì)，可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進行比較，如中國獸藥典方法或經(jīng)過驗證的方法。如不能測得雜質(zhì)的相對響應因子，可在線測定雜質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，如采用二極管陣列檢測器測定紫外光譜，當雜質(zhì)的光譜與主成分的光譜相似，則可采用原料藥的響應因子近似計算雜質(zhì)含量（自身對照法）。并應明確單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當于主成分的重量比（）或是面積比（）。4-5 精密度精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均質(zhì)樣品，經(jīng)多次取樣進行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程

13、度（離散程度）。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。用標準偏差或相對標準偏差表示時，取樣測定次數(shù)至少用6次結(jié)果進行評價。精密度可以從三個層次考察：重復性、中間精密度、重現(xiàn)性。4-5-1 重復性重復性系指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內(nèi)，由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度。重復性測定可在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9 次測定結(jié)果進行評價，如制備3 個不同濃度的樣品，各測定3 次，或100的濃度水平，用至少測定6 次的結(jié)果進行評價。4-5-2 中間精密度中間精密度系指在同一試驗室，由于試驗室內(nèi)部條件改變，如時間、分析人員、儀器設(shè)備，測定結(jié)果的精密度。驗證設(shè)計方案中的變動因素一般為日期、分析人員

14、、儀器設(shè)備。4-5-3 重現(xiàn)性重現(xiàn)性系指不同實驗室之間不同分析人員測定結(jié)果的精密度。當分析方法將被法定標準采用時，應進行重現(xiàn)性試驗。4-6 檢測限檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準確定量。該驗證指標的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此對雜質(zhì)限度試驗，需證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。4-6-1 直觀法直觀評價可以用于非儀器分析方法，也可用于儀器分析方法。檢測限的測定是通過對一系列已知濃度被測物的樣品進行分析，并以能準確、可靠檢測被測物的最小量或最低濃度來建立。4-6-2 信噪比法用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與

15、噪音信號進行比較，計算出可檢出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1 時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。其他方法有基于工作曲線的斜率和響應的標準偏差進行計算的方法等。無論用何種方法，均應用一定數(shù)量的樣品，其濃度為近于或等于檢測限，進行分析，以可靠地測定檢測限。4-7 定量限定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應具有一定的準確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質(zhì)定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準確測出。4-7-1 直觀法直觀評價可以用于非儀器分析方法，也可用于儀器分析方法，一般通過對一系列含有已知濃度被測物的樣品進行分

16、析，在準確度和精密度都符合要求的情況下，來確定被測物能被定量的最小量。4-7-2 信噪比法用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與噪音信號進行比較，計算出可檢出的最低濃度或量。常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比為10：1 時相應的濃度或注入儀器的量進行確定。其他方法有基于工作曲線的斜率和響應的標準偏差進行計算的方法等。無論用何種方法，均應用一定數(shù)量的樣品，其濃度為近于或等于定量限，進行分析，以可靠地測定定量限。4-8 耐用性耐用性系指測定條件發(fā)生細小變動時，測定結(jié)果保持不受影響的承受程度。耐用性主要考察方法本身對于可變試驗因素的抗干擾能力。開始研究分析方法時，就應考慮其耐

17、用性。如果測試條件要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。典型的變動因素包括：高效液相色譜法中流動相的組成、流速和pH 值，不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫等。氣相色譜法中載氣及流速、不同品牌或批號的色譜柱、固定相、擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。經(jīng)試驗，應說明小的變動能否通過方法的系統(tǒng)適用性試驗，以確保方法有效。4-9 系統(tǒng)適用性試驗對一些儀器測試方法，在進行方法驗證時，有必要將分析設(shè)備、電子儀器與實驗操作、測試樣品等一起當作完整的系統(tǒng)進行評估。系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進行評估的指標。系統(tǒng)適用性試驗參數(shù)的設(shè)置需根據(jù)被驗證方法類型而定。色譜方法對分析設(shè)備、電子儀器的依賴程度較高，因此所有色譜

18、方法均應進行該指標驗證，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分。具體驗證參數(shù)和方法參考中國獸藥典有關(guān)規(guī)定。5 方法再驗證在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行全面或部分驗證，以保證分析方法可靠，這一過程稱為方法再驗證。再驗證原則是根據(jù)改變的程度進行相應的再驗證。當原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定應無干擾。當制劑的處方組成改變、輔料變更時，可能會影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，因此需要對

19、鑒別、對含量測定影響的方法再驗證。當原料藥產(chǎn)地來源發(fā)生變更時，可能會影響雜質(zhì)檢查和含量測定的專屬性和準確度，因此需要對雜質(zhì)檢查方法和含量測定進行再驗證。當質(zhì)量標準中某一項目分析方法發(fā)生改變時，如采用高效液相色譜法測定含量時，檢測波長發(fā)生改變，則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，證明修訂后分析方法的合理性、可行性。同樣，已有國家標準的獸藥質(zhì)量研究中，基于申報的原料藥合成工藝、制劑處方中的輔料等一般無法保證與已上市產(chǎn)品的一致性，需對質(zhì)量標準中部分項目進行方法的再驗證。方法再驗證是對分析方法的完善過程，應根據(jù)實際改變情況進行再驗證，從而保證所采用的分析方法能夠控制產(chǎn)品的內(nèi)

20、在質(zhì)量。附表：檢驗項目和驗證內(nèi)容驗證項目 驗證內(nèi)容 鑒別 雜質(zhì)測定 含量測定及溶出量測定   定量 限度  準確度 精密度 重復性 中間精密度 專屬性 檢測限 定量限 線性 范圍 耐用性 -  - - + - - - - + +  + + + - + + + + -  - - + + - - - + +  + + + - - + + +   已有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度。 如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補充。  視具體情況予以驗證。6 對方法驗證的評價對于方法驗證，有以下幾個方面值得關(guān)注。6-1 有關(guān)方法驗證評價的一般考慮總體上，方法驗證應圍繞驗證目的和一般原則來進行，方法驗證內(nèi)容的選擇和試驗設(shè)計方案應系統(tǒng)