mRNA差異顯示技術(shù)在腫瘤研究中的應用

1、mRNA差異顯示技術(shù)在腫瘤研究中的應用 mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differential display）是一種快速而有效的克隆差異性表達基因的方法。1992年Liang 和Pardee1首次應用差異顯示技術(shù)對比人類乳腺癌細胞與正常乳腺上皮細胞所表達的mRNA，以此來克隆癌細胞所特有的基因。差異顯示技術(shù)為尋找新基因開辟了捷徑，是該領域的重大突破,已應用于各個領域，如農(nóng)業(yè)、植物、動物、醫(yī)學；就醫(yī)學而言，涉及了胚胎發(fā)育器官形成、遺傳性疾病、藥物作用原理、基因治療和免疫反應等研究領域，特別是在人類與腫瘤的戰(zhàn)斗中有著極為廣泛的用途。差異顯示的理論基礎是基因的選擇性表達。哺乳動物基因組約含100

2、000個不同的基因，對于某一細胞而言，僅一小部分（約15%）表達。在正常細胞的生長分化過程中，基因的選擇性表達決定著生命的進程；在病理過程中，作為疾病的原因或結(jié)果，也存在著表達的基因異常。因此克隆這些差異表達的基因是當前生物醫(yī)學領域的研究熱點，該領域的不斷深入將為從分子水平了解疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律奠定基礎，并為臨床合理的治療提供依據(jù)。差異顯示的關鍵在于選擇具有高度可比性，表型特性差異顯著的對比對象。可比性即嚴格控制遺傳背景，摒除無關差異，僅使所關注的表型（如腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能）具有顯著差異。差異顯示從表型差異入手，通過展示mRNA的差異深入到基因差異，克隆與表型差異高度相關的新基因。就技術(shù)而言

3、，差異顯示巧妙地結(jié)合了兩個基本的分子生物技術(shù)：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)及電泳。經(jīng)過不斷的改良，差異顯示已成為標準化的cDNA克隆方法，有多個公司的試劑盒及設備使研究者可在短時間內(nèi)啟動差異顯示，幾天內(nèi)獲得結(jié)果。較其他克隆新基因的方法而言，差異顯示具有簡便易行的優(yōu)勢，因此在基礎和臨床研究中有著推廣和普及的可能性。一、技術(shù)路線差異顯示技術(shù)實質(zhì)是RT-PCR,其獨特之處在于2種PCR引物的設計:錨定引物T12MN,含12個T可以結(jié)合于mRNA3端poly(A)，M為AGC 3種堿基之一，N為AGCT之一，如T12CA可結(jié)合于在poly(A)上游為GT的mRNA；隨機引物可以在與poly(A

4、)末端不同距離的多個位置上結(jié)合，因此差異顯示的產(chǎn)物是不同長度的cDNA片段混合物。通過隨機引物和錨定引物的多種組合,差異顯示有展示約10 000至15 000種mRNA的潛力，在DNA測序膠上對比細胞或組織中所表達的mRNA，從而尋找在不同細胞，不同發(fā)育和分化階段，不同部位差異表達的基因。目前引物的設計更為新穎有效，如GenHunter公司在引物末端加入HindIII酶切位點，便于克隆；Genomyx公司則在錨定引物5末端加入T7RNA多聚酶啟動子,在隨機引物3末端加入M13引物序列,便于直接合成反義RNA探針及直接的雙相測序。隨引物的延長,退火溫度可由40提高到46,提高了差異顯示的重復性。

5、另外可針對某一基因家族(如Ser/Thr激酶2,鋅指蛋白家族3)設計引物,使所獲得的差異基因相對集中。其技術(shù)路線為：首先提取高質(zhì)量的總RNA,DNA酶處理后利用錨定引物T12MN逆轉(zhuǎn)錄,其后應用相同的T12MN及隨機引物進行PCR擴增；同時摻入同位素來標記產(chǎn)物。產(chǎn)物用測序膠電泳分離，放射自顯影。將差異條帶切下，用相同的引物進行2次PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)標記制成探針，通過Northern雜交來驗證其在不同樣本中的表達差異，去除假陽性(RNase保護實驗由于雜交發(fā)生在小體積中有利于復性，可用來替代Northern雜交，特別是對于低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA更為用效，可以探測到單個細胞中15個拷貝數(shù)的mRNA)

6、。被證實的cDNA片段可克隆到T/A載體中進行測序，其序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進行同源性檢驗，便可確定是已知基因或者是與已知基因無顯著同源性的未知基因。目前已有多種非放射性標記方法,如溴化乙錠染色的瓊脂糖電泳4(簡便,但靈敏度低)、銀染5(快速,靈敏度高,便于切條帶)、熒光6(應用熒光成象系統(tǒng),自動, 靈敏度高,應用廣泛)及化學發(fā)光7。二、差異顯示的優(yōu)越性1.差異顯示僅需少量的總RNA（0.20.02 g,約相當于從200個細胞中所提取的總RNA）。這使 得材料來源困難的研究成為可能，如細針穿刺細胞學標本，內(nèi)窺鏡活檢標本等。用總RNA和poly(A)RNA做模板可獲得相同結(jié)果，這也說明在大量

7、的tRNA，rRNA存在的情況下，錨定引物T12MN能特異的結(jié)合于mRNApoly(A)的尾部。2.差異顯示應用PCR技術(shù)，起到了放大作用，敏感度高。為了篩選低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA已進行了許多改良，如Hakvoort等8將消減雜交與差異顯示結(jié)合，先通過雜交使差異片段富集，再進行并列比較，則低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA得到展示的可能性大大提高。又如Ralph等9通過2輪PCR擴增（巢式），第2輪引物較第1輪在3端多2個堿基，使與之匹配的模板減少，模板間的競爭減少,因此低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA易于被擴增。3.差異顯示在測序膠上同時并列比較2個或多個研究對象，比如轉(zhuǎn)移潛能高、中、低的癌細胞系，使后期在選擇差異片段

8、時有所參考。同時回收那些出現(xiàn)或消失的差異條帶，則可獲得“打開”或“關閉”的基因，比如同時克隆激活的癌基因和失活的抑癌基因。4.差異顯示可以在23周時間內(nèi)獲得結(jié)果。最大程度的排除假陽性依賴于三個層次：第一、不同濃度模板的平行反應，及重復實驗用于排除由于模板質(zhì)量數(shù)量而導致的假陽性。第二、嚴格地對照實驗，如用缺省逆轉(zhuǎn)錄酶或用RNase降解RNA做為陰性對照來排除DNA污染。第三、差異片段的初篩，如將研究對象RNA逆轉(zhuǎn)錄,摻入同位素制成探針，分別與點有所有差異片段的尼龍膜雜交(即反向點雜交)10，只有那些“此有彼無”的片段進入下一階段研究，該法有效的集中了目標，削減了繁重的后續(xù)工作。三、差異顯示在腫瘤

9、研究中的應用腫瘤發(fā)生是多步驟的過程，涉及到原癌基因的激活及抑癌基因的失活而導致的細胞失控性生長。在此綜述差異顯示在腫瘤研究中最多見的4種模式以備參考，可見巧妙地匹配研究對象使差異顯示成為克隆腫瘤相關基因、轉(zhuǎn)移相關基因的有力工具。1.差異顯示技術(shù)用于對比惡性腫瘤組織及其鄰近的正常組織：近年有很多將差異顯示技術(shù)應用于臨床手術(shù)標本的報道，對比對象涉及腦腫瘤、甲狀腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌組織及與其對應的正常組織，試圖克隆與癌發(fā)生相關的基因。Meyer-Siegler和Hudson11將差異顯示用于前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與正常前列腺組織的對比研究，獲得166 bp的cDNA片段在轉(zhuǎn)移灶高表達，

10、與人類巨噬細胞移動抑制因子（MIF）93%同源，并在臨床已轉(zhuǎn)移的前列腺癌手術(shù)標本中得到證實。高表達的MIF將有可能成為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的診斷標志物。對于臨床工作者來說，差異顯示技術(shù)無疑有著標本來源豐富的優(yōu)勢，使臨床研究深入到基因水平。但必須意識到慎重選擇對比對象的重要性,以確保二者具有高度可比性。如果能找到在臨床指標如治療反應、復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率、生存率等方面高度可比的模型，則所克隆基因有可能成為新的診斷及預后的分子標志物。2.差異顯示用于腫瘤細胞系的研究：腫瘤基礎研究中已建立了許多腫瘤細胞系及亞系，具有遺傳背景一致、表型差異單純的優(yōu)勢，是差異顯示良好的模型。為了研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因，Lim等12以

11、鼠結(jié)腸腺癌細胞系的3個具有不同轉(zhuǎn)移潛能亞系作為差異顯示的對象。當接種于裸鼠時，NL4亞系無轉(zhuǎn)移能力，而NL17亞系（i.v.）和NL22亞系(s.c.)在肺部形成巨大轉(zhuǎn)移灶。各細胞系轉(zhuǎn)移表型的差異反映了其基因水平的差異。差異顯示獲得新基因HMC在高轉(zhuǎn)移亞系NL17及NL22中高表達，在低轉(zhuǎn)移亞系NL4中極低表達。Northern雜交證明在13例結(jié)腸癌病人中7例的原發(fā)癌灶及轉(zhuǎn)移灶HMC表達較正常粘膜高，最高可達38倍。HMC與有絲分裂調(diào)控蛋白家族有部分同源性，為其功能研究提供了線索。為了探討乳腺癌演進過程中表達基因的變化，研究者以乳腺癌細胞系MCF-7及MCF-7ADR作為研究對象13。這兩個細

12、胞系是乳腺癌演進的模型：MCF-7代表乳腺癌早期，雌激素依賴，雌激素受體陽性，三苯氧胺治療有效，波形蛋白陰性，對阿霉素敏感，體外matrigel侵襲試驗及裸鼠體內(nèi)試驗均不侵襲轉(zhuǎn)移；相反MCF-7ADR代表進展期乳腺癌，不依賴雌激素，雌激素受體陰性，三苯氧胺治療無效，波形蛋白陽性，對阿霉素不敏感，表現(xiàn)出體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力。差異顯示獲得了一個新基因PAP在MCF-7ADR中高表達，其在進展期乳腺癌細胞系MCF-7ADR中的作用尚待研究。3.差異顯示用于轉(zhuǎn)染細胞的研究：細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在腫瘤研究中正被廣泛應用，差異顯示對比轉(zhuǎn)染前后,可用來研究所轉(zhuǎn)染基因的下游基因及作用途徑。將最早被克隆的癌基因ras及突

13、變率最高的抑癌基因p53（溫度敏感型）共轉(zhuǎn)染鼠胚胎纖維母細胞(REF)得到亞系A1-5,在非許可溫度培養(yǎng)時p53為突變型，在許可溫度培養(yǎng)時p53為野生型14。提取各細胞系mRNA并列比較，獲得新基因mob-1，不論p53蛋白是突變型還是野生型，mob-1在共轉(zhuǎn)染后均高表達，可見其高表達由ras所誘導而與p53無關。mob-1編碼產(chǎn)物為分泌性多肽，與前炎癥細胞因子家族成員IP-10同源，其意義在于將慢性炎癥反應，ras的活化及癌變聯(lián)系起來，并有可能成為ras發(fā)生突變的分泌型分子標志物。研究者通過微細胞介導將正常的人類6號染色體轉(zhuǎn)入人類黑色素瘤細胞系Me1JuSo及其高轉(zhuǎn)移亞系C1861，雖然不影

14、響其成瘤率，但抑制其轉(zhuǎn)移率至少95%，提示位于6號染色體上的基因可能調(diào)控著基因組中轉(zhuǎn)移抑制基因的表達，差異顯示使在基因水平探討此顯著的轉(zhuǎn)移抑制作用成為可能15。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后激活新基因Kiss-1。將Kiss-1轉(zhuǎn)染人類黑色素瘤細胞系Me1JuSo及其高轉(zhuǎn)移亞系C1861并穩(wěn)定表達后，接種裸鼠體內(nèi)無1例發(fā)生轉(zhuǎn)移?？梢姴町愶@示使研究者從表面現(xiàn)象的研究迅速深入到基因水平。4.差異顯示用于外源性因素作用機制的研究：人為的給予或去除某種外源性因素（如藥物，激素，化學物質(zhì)，紫外線）作用一段時間后，差異顯示對比處理前后mRNA，在基因水平揭示外源性因素的作用機制。三苯氧胺（tamoxifen）對人類乳腺癌

15、細胞增生具有顯著抑制作用，20年來被用于臨床治療乳腺癌病人。為了探討其藥理作用，有研究者提取正常乳腺及人類乳腺癌組織在三苯氧胺治療前，治療中的mRNA進行對比16，分離到一個202 bp的cDNA(AP5-1)在正常及治療前表達，而治療后缺失。AP5-1與CD36基因有99%同源性，而后者為細胞外基質(zhì)蛋白凝血酶敏感蛋白(thrombospondin-1)的受體。已知其參與腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移、浸潤及血管形成?？梢娙窖醢吠ㄟ^使其受體下調(diào)而發(fā)揮抗腫瘤作用。宮頸細胞的癌變是多因素多步驟的過程。HPV感染是主要原因，但病毒感染者癌變的長潛伏期及少于50%的癌變率說明癌變需要其他因素共同作用，如吸煙17

16、。人正常宮頸細胞(HEN)在HPV16感染后成為永生的細胞系(HEN-16)，接種裸鼠皮下不成瘤。HEN-16培養(yǎng)時加入香煙冷凝物作用一段時間后，接種裸鼠皮下成瘤，由此來源的細胞系稱HEN-16-2。上述3個細胞系代表了宮頸癌變的兩個因素，三個階段。差異顯示比較了3個細胞系的mRNA后獲得新基因PA4在永生細胞HEN-16及轉(zhuǎn)化細胞HEN-16-2中高表達，表達水平是正常細胞的23倍，而另一新基因PA9僅在正常宮頸細胞中表達。差異顯示清楚的再現(xiàn)了HPV感染，吸煙使癌基因PA4活化，抑癌基因PA9失活而導致宮頸癌變的過程。綜上所述，差異顯示技術(shù)簡便易行，廣泛應用于各個領域。選擇各自研究領域所特有

17、的，巧妙匹配的研究對象，應用成熟的差異顯示技術(shù)，可在短時間內(nèi)克隆新基因，在基因水平探討各種生理及病理過程。參考文獻1Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257：967-971.2McClelland M, Ralph D, Cheng R, et al. Interactions among regulators of RNA abundance characterized us

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