激光掃描共聚焦顯微術(shù)在淋巴瘤研究中的應(yīng)用

1、    激光掃描共聚焦顯微術(shù)在淋巴瘤研究中的應(yīng)用        激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）自80年代初問(wèn)世以來(lái)，較好地解決了掃描過(guò)程中的熒光標(biāo)本的光漂白等作用，像清晰度高，特別適用于觀察較大標(biāo)本的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，其三維重建功能清晰顯示了膜和核的關(guān)系，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域和工業(yè)固體材料的顯微結(jié)構(gòu)研究1。血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞性淋巴瘤（angioimmunoblastic T-cell lymph

2、oma, AILD-TCL），是系統(tǒng)性的淋巴增生性疾病。臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大、皮疹等，并包括多項(xiàng)血液指標(biāo)的改變。形態(tài)學(xué)上有淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞、“燒光”的生發(fā)中心、血管增生、過(guò)碘酸雪夫染色(PAS)陽(yáng)性物質(zhì)沉積等。CD44是分布廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白分子，主要參與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的特異性粘連過(guò)程。CD44s (標(biāo)準(zhǔn)型CD44) 可促進(jìn)局部腫瘤的形成, 主要分布在細(xì)胞膜上。Ki-67是Gerdes等21983年報(bào)道的一種單克隆抗體，其抗原存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)，是與細(xì)胞增殖相關(guān)的一組核蛋白。我們用LSCM技術(shù)和雙重免疫組織化學(xué)染色作對(duì)比，來(lái)觀察AILD-TCL的CD44s和Ki-

3、67的表達(dá)，進(jìn)一步研究AILD-TCL中增生細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。一、材料與方法1.病例來(lái)源：病例來(lái)自本院病理科1998年的冷凍和石蠟組織。2.儀器設(shè)備：激光掃描共聚焦顯微鏡MRC-1024ES型（英國(guó)Bio-Rad公司），主要包括倒置顯微鏡、激光光源、電腦控制和輸出等4部分。電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Sheldon Manufacturing公司）。3.試劑和方法：將石蠟標(biāo)本行4 m連續(xù)切片，作雙重免疫組織化學(xué)染色。第一步采用免疫組織化學(xué)SP法（一抗用CD44s，Zymed，即用型產(chǎn)品），用DAB顯色；第二步采用免疫組織化學(xué)APAAP法（一抗用Ki-67，MIB1同上公司產(chǎn)品），用氮藍(lán)四唑/五溴-四氯三吲

4、哚磷酸酯（NBT/BCIP）顯色，甲基綠復(fù)染細(xì)胞核。將冷凍標(biāo)本行10 m連續(xù)切片，作雙重免疫熒光染色。一抗采用CD44s（同上）和Ki-67（同上）。步驟：將冷凍切片置于4%多聚甲醛中固定，室溫下20 min；0.01mol/L PBS緩沖液蕩洗；150正常兔血清封閉；棄去血清，直接滴加Ki-67單抗的稀釋液（1100），37下孵育60分鐘；PBS蕩洗，加異硫酸熒光素（FITC）標(biāo)記的兔抗鼠IgG（180，Dako公司）37下孵育30 min； PBS液蕩洗，加雙標(biāo)染色增強(qiáng)劑（同上公司，即用型產(chǎn)品）1滴，室溫下30分鐘；棄去增強(qiáng)劑，直接滴加CD44s，37下孵育2 h； PBS蕩洗，加藻紅蛋白

5、RPE標(biāo)記的兔抗鼠IgG（140，Dako公司），37下孵育30 min； PBS液蕩洗，緩沖甘油（甘油和PBS液11混合）封片。4.激光共聚焦顯微鏡斷層掃描：選擇參數(shù)如下：激光光源波長(zhǎng)488 nm/514 nm,氪-氬離子激光器功率25 mW，像尺寸512×512像素。掃描模式為XY和XZ。（1）雙重?zé)晒鈽?biāo)記和細(xì)胞“CT”：將染色好的標(biāo)本放在LSCM（60×油鏡）上進(jìn)行預(yù)掃描，確定細(xì)胞的頂部后，按Z軸步距(0.5 m)逐層往細(xì)胞底部掃描，計(jì)算機(jī)同時(shí)記錄每層的像數(shù)據(jù)。探測(cè)器選用高靈敏度光電倍增管2個(gè)，可見(jiàn)光激發(fā)。在第二通道先掃描細(xì)胞膜，然后于第一通道掃描細(xì)胞核，二者在Fra

6、me/overl2下重疊成像。（2）三維重建： 先確定細(xì)胞的頂部，然后按Z軸步距(0.5 m)逐層往細(xì)胞底部掃描，通過(guò)SFP（simulated fluorescence process）選項(xiàng)，獲得清晰三維像。（3）攝像：在輸出設(shè)備Video-Printer下對(duì)雙重?zé)晒鈽?biāo)記、細(xì)胞“CT”和三維重建所產(chǎn)生的像進(jìn)行全屏幕攝影。二、結(jié)果1.雙重免疫組織化學(xué)染色：細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞膜呈棕色，在部分細(xì)胞（透明細(xì)胞及免疫母細(xì)胞）上可見(jiàn)CD44s 和Ki-67的共表達(dá)（1）。 1部分透明細(xì)胞及免疫母細(xì)胞呈CD44s棕色胞膜陽(yáng)性表達(dá)，Ki-67胞核紫藍(lán)色陽(yáng)性表達(dá)雙重免疫組織化學(xué)法×3502.雙重?zé)?/p>

7、光標(biāo)記和細(xì)胞“CT”：細(xì)胞核呈黃綠色，細(xì)胞膜呈紅色，在部分細(xì)胞（透明細(xì)胞及免疫母細(xì)胞）上可見(jiàn)CD44s 和Ki-67的共表達(dá)（2）, 能清晰顯示膜和核的關(guān)系。3.三維重建：激光共聚焦顯微鏡斷層掃描的信息用SFP選項(xiàng)進(jìn)行偽彩色三維重建，重建像的各種信息均可在屏幕上顯示3。像上可見(jiàn)：中等大的透明細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，染色質(zhì)細(xì)，核仁小，大透明細(xì)胞核呈圓形或輕度不規(guī)則，有嗜酸性細(xì)胞樣的核仁。膜與核的間隙較寬，是豐富淡染的水樣胞質(zhì)的位置。這些像可在X，Y，Z軸上任意角度旋轉(zhuǎn)顯示。2冷凍切片，激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)Ki-67標(biāo)記呈胞核陽(yáng)性(黃綠色熒光)，CD44s呈胞膜陽(yáng)性(紅色熒光)，部分細(xì)胞有二者的共

8、表達(dá)雙重免疫熒光法×600三、討論1.我們應(yīng)用激光共聚焦顯微技術(shù)得到AILD-TCL的高質(zhì)量像，原理如下：（1）一般熒光顯微鏡在觀察樣本時(shí)，焦點(diǎn)平面以外的熒光會(huì)減低像的清晰度，顯示的是平面疊加象。而LSCM在觀察某一焦點(diǎn)平面的熒光時(shí)，把焦點(diǎn)平面以外的熒光刪除，得到焦點(diǎn)平面清晰的像。（2）LSCM采用臺(tái)階掃描方式，把激光束固定于一個(gè)完整的光軸上，對(duì)樣品進(jìn)行掃描而建立共焦像，避免了因偏軸掃描產(chǎn)生的橫向色差效應(yīng)，因此大大提高像的分辨率，獲得高質(zhì)量像資料。雙重?zé)晒鈽?biāo)記和三維重建還可顯示不同光切面的膜和核的相互關(guān)系，為研究2種或2種以上相關(guān)因素的關(guān)系提供了方便。2.我們僅應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的

9、部分技術(shù)，觀察CD44s和Ki-67在AILD-TCL的表達(dá)，較雙重免疫組織化學(xué)的結(jié)果為好。由于激光共聚焦顯微鏡的像清晰度高，獲得了細(xì)胞內(nèi)部不同的信息，拓寬對(duì)淋巴瘤的抗原表達(dá)研究的視野，由平面水平深入到立體水平，克服了普通光鏡的局限性。因而為研究淋巴瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)和提高病理診斷水平提供了一種新的手段。作者單位：王雪（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610041 成都）李甘地（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610041 成都）張杰（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610041 成都）步宏（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610041 成都）李俸媛（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610

10、041 成都）劉衛(wèi)平（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610041 成都）張尚福（四川華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科610041 成都）參考文獻(xiàn)1，Knoester A, Brakenhoff GJ. Applications of confocal microscopy in industrial solid materials: some examples and first evaluation. J Microsc, 1990，157：105.2，Gerdes J,Schwabu, Lemke H, et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with