基因組水平上探索基因表達代謝及遺傳控制調控網絡

1、基因組水平上探索基因表達代謝及遺傳控制調控網絡報告提綱 調控網絡概述調控網絡的分類調控網絡的研究方法在基因水平上探索基因表達的代謝和遺傳控制 調控網絡概述 在生物機體內，所有生命活動過程都受到嚴格的調節(jié)控制，以最有效地方式和途徑適應內外環(huán)境的變化，以有利生物機體的生存繁衍，這些調節(jié)控制可以從不同的層次水平，通過不同的途徑和方式，以不同的機制進行調控，而且，不同的調節(jié)途徑和方式彼此之間可以發(fā)生有機的聯系，相互作用、相互影響，協(xié)調一致，從而構成了復雜的調控網絡。 調控網絡的分類可根據不同功能分類：神經調控網絡免疫調控網絡代謝調控網絡激素調控網絡細胞內信號傳導調控網絡基因表達水平的調控網絡 調控網絡

2、的研究方法組織及細胞學方法基因突變技術突變體篩選基因工程技術基因缺失基因過表達轉基因技術生物芯片技術基因芯片蛋白質芯片 在基因水平上探索基因表達的代謝和遺傳控制Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale Joseph L. DeRisi, Vishwanath R. Iyer, Patrick O. Brown Science Vol. 278. 24 Oct. 1997: 680686目前， 10多種微生物的基因組全序列已測定。在以后幾年中，將有望知道幾種多細胞生物的基因組

3、全序列，其中包括人類基因組序列。然而，在這些基因組中，明確每一種基因的功能和作用將是一項十分艱巨的任務，而且從整體水平上了解基因組在生物機體復雜的生命歷程中如何發(fā)生作用，對于我們將更是一個嚴峻的挑戰(zhàn)。知道一個基因何時何地被表達常常為其生物學作用提供了強有力的線索。相反，在一個細胞中，不同基因的表達模式能夠為細胞所處狀態(tài)提供詳細的信息。盡管蛋白質豐度的調節(jié)在一個細胞中絕不單獨通過mRNA的調控來完成，但實際上細胞類型或狀態(tài)的所有差異則與許多基因的mRNA水平的改變有關。這是偶然的，因為對特定基因測定其mRNA含量則需要一特效試劑，即是其cDNA序列。DNA微陣列技術（基因芯片），是將數千個單個基

4、因序列高密度排列在一張顯微鏡載玻片上，這種技術為在大規(guī)模的研究基因表達提供了一種實用經濟的工具。 釀酒酵母是一種進行基因表達的系統(tǒng)觀察研究特別好的研究材料。這些基因在基因組序列中容易識別，順式調控元件通常緊湊并靠近轉錄單元，有關它的遺傳調控機制已經了解很多，并且一套有力的工具可用于它的分析。酵母糖代謝的一般特點酵母自然生長史中的一個重復循環(huán)包含了從厭氧（發(fā)酵作用）到需氧（呼吸作用）代謝的轉換。將酵母接種到富含糖的基質中會引發(fā)由發(fā)酵提供能量的快速生長，產生乙醇。當可發(fā)酵的糖用盡時，酵母細胞轉向將乙醇作為碳源供有氧生長。 這個基于葡萄糖損耗的從厭氧生長到需氧呼吸的轉換，即指如雙峰轉換（Diauxi

5、c shift）.該轉換與涉及到細胞基本代謝過程中的基因表達中普遍改變有關，這些代謝包括碳代謝、蛋白質合成，和碳水化合物儲存等。Fig. 3. Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression. 酵母中的代謝途徑糖酵解有氧呼吸TCA循環(huán)乙醛酸循環(huán)糖異生我們使用DNA微陣列來刻畫整個基因組的基因表達過程的變化，并研究調控和執(zhí)行該過程的遺傳途徑基因芯片技術研究糖代謝中基因表達調控的一般過程DNA微陣列制備6400個DNA序列提取制備RNA探針制備熒光標記cDNA雜交酵母細胞反轉錄指

6、數生長的細胞的不同培養(yǎng)階段圖解說明圖解說明DNA微陣列制備：微陣列制備：利用購買的一組引物對, 將酵母的開放閱讀框部分通過PCR放大.，包含大約6400個清楚的DNA序列，被用一個簡單的自動機械印刷裝置印刻在玻璃載片上, 構成相應的DNA微陣列。mRNA探針制備：探針制備：將來自以指數生長培養(yǎng)的酵母細胞接種到新鮮的基質中在30C生長21小時。在開始生長9小時后，然后依次獲得經歷間隔2小時7個不同階段連續(xù)培養(yǎng)的樣品，并分離制備mRNA 。cDNA制備：制備：通過或 Cy5(紅色紅色)-標記的dUTP經反轉錄制備熒光標記的cDNA，雜交：雜交： cDNA與微陣列雜交。觀察、分析觀察、分析圖解說明圖

7、解說明為使識別基因表達水平變化的可靠性最大化，我們標記了從每個連續(xù)間隔時間點培養(yǎng)的細胞中獲得的cDNA, 用Cy5標記，然后將其與的對照cDNA樣品混合 ，后者來自于從接種后的第一個間隔時間得到的細胞。在這個實驗設計中，測量每一個排列單元和Cy5熒光物質的相對熒光強度，可以提供為兩個細胞群體中對應mRNA的相對豐度的一個可靠量度(Fig. 1)。來自7個樣品的系列數據（見Fig. 2）, 由超過43000表達率量度單位組成，被組織成一個數據庫, 以推動對實驗結果的進一步探索和的高效分析。該數據庫可在網上公開獲得。Fig. 1. Yeast genome microarray 在這個實驗設計中，

8、測量每一個排列單元和Cy5熒光物質的相對熒光強度，可以提供為兩個細胞群體中對應mRNA的相對豐度的一個可靠量度Fig. 2. The section of the array indicated by the gray box in Fig. 1 在一個細胞中，不同基因的表達模式能夠為細胞所處狀態(tài)提供詳細的信息。盡管蛋白質豐度的調節(jié)在一個細胞中絕不單獨通過mRNA的調控來完成，但實際上細胞類型或狀態(tài)的所有差異則與許多基因的mRNA水平的改變有關。 Fig 1. Yeast genome microarrayTDH1催化PEPGA-3-PPDC1催化丙酮酸乙醛ALD2乙醛酸脫氫酶Fig. 1 圖

9、解說明圖解說明熒光標記cDNA探針是來自于從接種后不久的細胞中分離得到的mRNA（培養(yǎng)密度5 106 cells/ml，基質葡萄糖水平為19 g/liter）, 在Cy3-dUTP存在下的通過反轉錄制備。類似的，另一個探針來自培養(yǎng)小時后分離的同一細胞群中的mRNA（培養(yǎng)密度2 108 cells/ml，基質葡萄糖水平為0.2 g/liter）, 在Cy5-dUTP存在下通過反轉錄制備。在這幅圖中，Cy3-dUTP-labeled cDNA的雜交（即，mRNA在初始時間點的表達）顯示為綠色信號，Cy5-dUTP-labeled cDNA的雜交（即，mRNA在小時的表達）顯示為紅色信號。這樣，雙峰

10、轉換后被誘導或抑制的基因在本圖中就分別顯示為紅色和綠色的斑點。雙峰轉換前后表達水平大致相等的基因在本圖中顯示為黃色斑點。在用于分析雙峰轉換期間在用于分析雙峰轉換期間基因表達的每個微陣列中基因表達的每個微陣列中。在用于分析在用于分析tup1突變和突變和YAP1 過表達影響的陣列中過表達影響的陣列中注意區(qū)分明顯的基因組是注意區(qū)分明顯的基因組是在不同的實驗中被誘導和在不同的實驗中被誘導和抑制的。抑制的。在在600nm的光密度下測量的的光密度下測量的細胞密度是用于測量培養(yǎng)細胞密度是用于測量培養(yǎng)物的生長情況。物的生長情況。 Fig. 2. Fig. 1中灰色方框標記的部分中灰色方框標記的部分陣列所顯示所

11、描述的每組實驗陣列所顯示所描述的每組實驗 Fig. 2. 圖解說明圖解說明酵母在Glu培養(yǎng)基上進行指數生長的過程中， 其基因表達的整體情況是相當穩(wěn)定的。在比較最初兩個細胞樣品的基因表達情況時（間隔2小時收獲），19個基因(0.3%)的mRNA水平差異2 倍或2倍多，最大的差異也僅有倍。Fig. 2. 圖解說明圖解說明然而，當培養(yǎng)基中的Glu被逐漸消耗時，基因表達的整體情況可發(fā)生明顯的變化。大約710個個基因的mRNA水平被誘導至少增加了至少增加了2倍倍; 大約1030個個基因的mRNA水平下降了至少下降了至少2倍倍; 183個個基因的mRNA水平至少增加了增加了4倍倍; 203個個基因的mRN

12、A水平至少減少了減少了4倍倍。目前，這些表達不同的基因中大約有一半其功能還沒有被認識，而且也沒有命名。相對于那些功能已知的基因而言, 400多個表達不同的基因沒有明顯同源性. 因此，這些以前尚未被認識的基因對雙峰轉換的應答，首次為了解它們的作用提供了有益的線索。紅框白字紅框白字確定了在雙峰轉換中表達增加的基因。綠框深綠字綠框深綠字確定了在雙峰轉換中表達降低的基因。黑白框表示無顯著差異表達（小于2倍）。連接可逆酶促反應步驟的箭頭方向，表示從基因表達情況中推斷出的雙峰轉換后中間代謝物代謝方向。基因被強烈誘導表達的酶催化的反應步驟，用突出的紅色箭頭表示。寬灰色的箭頭表示從基因表達情況中推斷出的雙峰轉

13、換后代謝物主要增加的流向。Figure 3. Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression.Fig. 3. 從基因表達改變的全局分從基因表達改變的全局分析中推斷得到的糖代謝調整圖譜。析中推斷得到的糖代謝調整圖譜。圖中圖中只確定了關鍵的中間代謝產物。編碼代謝通路中催化每一步反應的酶的酵母基因名字在方框中給出。編碼琥珀酰CoA合成酶和肝糖脫支酶的基因尚未明確鑒別（給出），但ORFs YGR244 和 YPR184分別表現出與琥珀酰CoA合成酶和肝糖脫支酶顯著的同源性，因此被標注

14、在該圖的相應步驟中。紅框白字確定了在雙峰轉換中表達增加的基因。綠框深綠字確定了在雙峰轉換中表達降低的基因。這些基因的誘導和抑制程度在圖中也顯示出來。對多亞基酶復合體，如琥珀酸鹽脫氫酶，標注的誘導倍數代表框中所列的所有基因的一個無關緊要的平均數。黑白框表示無顯著差異表達（小于2倍）。連接可逆酶促反應步驟的箭頭方向，表示從基因表達情況中推斷出的雙峰轉換后中間代謝物代謝方向。基因被強烈誘導表達的酶催化的反應步驟，用突出的紅色箭頭表示。寬灰色的箭頭表示從基因表達情況中推斷出的雙峰轉換后代謝物主要增加的流向。 Fig. 3 圖解說明圖解說明那些功能已知的基因在表達過程中所表現出的各種變化，這些變化為我們

15、展現了一幅細胞通過何種方式有效適應環(huán)境變化的鮮明生動的圖畫。圖3顯示了與糖代謝和能量代謝有關的酵母代謝途徑。我們將觀察到的mRNA編碼的每一個酶的變化，通過圖解標注在一個代謝通路的框架上，從而使我們能據此推斷代謝體系中代謝物的代謝去路。Fig. 3 圖解說明圖解說明實驗中，我們觀察到醛脫氫酶(ALD2)和乙酰輔酶A合成酶(ACS1)被大量誘導合成，這兩種酶的作用就是一起將乙醇脫氫酶的產物，即乙醛，轉化為乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A則進一步參與三羧酸循環(huán)（TCA）和乙醛酸循環(huán)（支路），為其提供能量原料。隨著編碼丙酮酸脫羧酶的基因轉錄停止和丙酮酸羧化酶的誘導合成，從而使丙酮酸代謝轉向合成草酰乙酸，而不

16、再生成乙醛，為TCA循環(huán)和糖異生提供原料。由于編碼磷酸烯醇丙酮酸羰激酶基因PCK1和編碼1,6-二磷酸果糖的基因FBP1兩個關鍵基因被誘導轉錄，逆轉了糖代謝過程中的兩個不可逆反應的代謝方向，從而使代謝沿著糖酵解途徑的可逆反應逆向朝著合成-磷酸葡萄糖（6-P-G）方向進行。誘導編碼海藻糖合成酶和糖原合成酶復合體的基因轉錄，可進一步促進6-P-G轉化合成海藻糖和糖原進入糖儲存途徑。Figure 4. Coordinated regulation of functionally related genes.曲線代表在每個指定組中所有基因的平均誘導和抑制率。幾類基因，如幾類基因，如細胞色素細胞色素C相

17、關基因，和那些參與相關基因，和那些參與TCA/乙醛酸循環(huán)和糖儲乙醛酸循環(huán)和糖儲藏反應途徑的相關基因，在葡萄糖消耗時藏反應途徑的相關基因，在葡萄糖消耗時它們同等地它們同等地被誘導表達被誘導表達。相反，相反，蛋白質合成的有關基因蛋白質合成的有關基因，包括，包括核糖體蛋白，核糖體蛋白，tRNA合成酶，和翻譯、合成酶，和翻譯、延長及初始因子的基因延長及初始因子的基因等，則表現出同等程度地等，則表現出同等程度地表達降低表達降低。Fig. 4. 功能性相關基因的協(xié)同調控功能性相關基因的協(xié)同調控各群組中基因的總數如下：核糖體蛋白，112;轉錄延長和起始因子，25;tRNA合成酶(不包括線粒體合成酶), 17

18、;肝糖原和海藻糖合成和降解，15;細胞色素C氧化酶和還原酶蛋白，19;TCA和乙醛酸循環(huán)酶，24。 正如編碼關鍵酶的基因表達的改變能增強對代謝程途徑調整調認識一樣，大批量功能相關基因的表達行為分析，可以為研究酵母細胞適應多變環(huán)境的系統(tǒng)方法提供寬廣視野。幾類基因，如細胞色素C相關基因，和那些參與TCA/乙醛酸循環(huán)和糖儲藏反應途徑的相關基因，在葡萄糖消耗時它們同等地被誘導表達。相反，蛋白質合成的有關基因，包括核糖體蛋白，tRNA合成酶，和翻譯、延長及初始因子的基因等，則表現出同等程度地表達降低。在雙峰轉換過程中，超過95%的核糖體基因的表達至少降低2倍（Fig. 4）。一個值得注意且有啟發(fā)性的例外

19、是編碼線粒體核糖體的基因在葡萄糖限制后通常是被誘導，而不是被抑制，這對線粒體的生物發(fā)生是十分必要的。當從酵母基因組中了解到更多關于每個基因的功能時，通過其全體基因表達模式獲得深入了解細胞適應環(huán)境變化的能力將變得愈加強大。 Fig. 4. 圖解說明圖解說明Figure 5. Distinct temporal patterns of induction or repression help to group genes that share regulatory properties.細胞密度的時序分布圖只在最后的時間點（小時）表現出強誘導（大于9倍）的 7個基因7個在小時時間點早期誘導時mRN

20、A水平上有一個峰。細胞色素C氧化酶和泛醌細胞色素C還原酶基因。有一個與雙峰轉換一致的誘導標記雙峰轉換前被抑制，并持續(xù)抑制進入穩(wěn)定階段的基因核糖體蛋白基因包含一大類被抑制在葡萄糖降解（階段）的基因。Fig. 5. 誘導和抑制的不同時序模式有助于將基誘導和抑制的不同時序模式有助于將基因根據它們共同調控特性分為相應的組：因根據它們共同調控特性分為相應的組：細胞密度的時序分布圖，在600nm OD測定和基質中葡萄糖濃度。7個基因表現強誘導（大于9倍）只在最后的時間點（小時）。除IDP2外，這些基因的每一個都有一個CSRE UAS。沒有發(fā)現適合這張分布圖的額外基因。被標記的一類基因中有7個在小時時間點早

21、期誘導時mRNA水平上有一個峰。這些基因中在上游啟動子區(qū)域都含有STRE重復基序。細胞色素C氧化酶和泛醌細胞色素C還原酶基因。被一個與雙峰轉換一致的誘導標記，這些基因都含有一個HAP2,3,4 蛋白復合體識別的共有結合基序。至少17個基因具有相似的表達分布圖。SAM1, GPP1,和幾個未知功能的基因在雙峰轉換前被抑制，并持續(xù)抑制進入穩(wěn)定階段。核糖體蛋白基因包含一大類被抑制在葡萄糖降解（階段）的基因。這些基因在其啟動子上游都包含一個和多個的RAP1結合基序。RAP1是大多數核糖體蛋白中的一個轉錄調控子。Fig. 5具有相同表達分布圖的來自額外群組的基因的例子在Fig. 5, C到F中顯示。在F

22、ig. 5C中，已命名基因的上游序列都具有應激反應元件（STRE），但HSP42例外，以前研究表明它們至少部分受這些調控元 件(21-24)。Fig. 5C中顯示的對HSP42 和兩個未描述特征的基因 (YKL026c，一個與谷胱甘肽過氧化酶有相似性的假想蛋白；YGR043c ，一個假定的二羥丙酮基轉移酶) 的上游序列進行的研究 ，揭示這些基因中也都有應激反應基序CCCCT的上游重復序列。在這張表達分布圖上的酵母基因組中的13個額外基因中（包括HSP30, ALD2, OM45, 和10個未表明特征的開放閱讀框（ORFs）（基因 ） (25)），有9個在其上游區(qū)域含有一個和多個可識別的STRE位點Fig. 5異源三聚體的轉錄活化因子復合體HAP2,3,4已顯示對呼吸過程中幾個至關重要基因的誘導發(fā)揮作用(26-28)。該復合體結合一個簡并性的共有序列，已知為CCAAT盒子 (26)。利用共有序列TNRYTGGB進行計算機分析，已提示參與呼吸作用的大量基因可能為HAP2,3,4的特定靶點(30)。確實，在7個細胞色素c相關基因的每一個基因的上游序列中，均能發(fā)現一個假定的HAP2,3,4結合位點，這7 個基因顯示出最大程度的誘導表達(Fig. 5D)。在12個被誘導表達的額外細胞色素C相關基因中，除一個例外，其余11個均有 HAP2,3,4結合位點。值