健骨二仙提取液對去卵巢大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)的影響

1、健骨二仙提取液對去卵巢大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)的影響                        【摘要】  目的 探討健骨二仙提取液對去卵巢大鼠皮質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)的影響，進(jìn)一步研究該藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理。方法 將只月齡雌性近交系大鼠隨機(jī)分為組：假手術(shù)組、單純?nèi)ヂ殉步M（即模型組）、卵巢切除健骨二仙提取液（即治療組）、卵巢切除倍美力組（即倍

2、美力組），采用去卵巢方法進(jìn)行骨質(zhì)疏松造模，周后藥物干預(yù)治療周，采用皮下注射鹽酸四環(huán)素和鈣黃綠素進(jìn)行骨表面的雙熒光標(biāo)記，全部處死大鼠取右脛骨中段不脫鈣骨切片進(jìn)行骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)測定。結(jié)果 與去卵巢組相比較，治療組骨髓腔總面積減小（），外膜面的骨形成各項參數(shù)均無明顯變化，治療組和倍美力組骨內(nèi)膜面的骨吸收參數(shù)均降低（），治療組內(nèi)膜面骨形成參數(shù)降低（或），使皮質(zhì)骨轉(zhuǎn)換水平比倍美力組更接近假手術(shù)組水平。結(jié)論 健骨二仙提取液可抑制去卵巢后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的形成，總體抑制骨吸收大于骨形成，減少了骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)退化，是該藥防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理之一。 【關(guān)鍵詞】  健骨二仙提取液；原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥；

3、骨形態(tài)計量學(xué)；實(shí)驗(yàn)研究；動物；大鼠；龜板膠；鹿角膠；人參      （， ， ） ： （） ， （） ， （） （） ， ， ， （）， ， （） （ ） ， ，     ； ； ； ；    原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種常見的老年性骨代謝疾病，我們采用益氣補(bǔ)腎法治療該病取得較為滿意的臨床療效，并對該藥的作用機(jī)理進(jìn)行了研究及報道。為進(jìn)一步考察其對骨形態(tài)學(xué)的影響，以健骨二仙提取液對去卵巢大鼠進(jìn)行了脛骨中段皮質(zhì)骨骨形態(tài)計量學(xué)研究，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報道如下。    材料與方法

4、      材料      動物  月齡雌性 級近交系大鼠（中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：中科動管第號）只，體質(zhì)量（±）。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心二級動物實(shí)驗(yàn)室（環(huán)境設(shè)施合格證號：）。      藥物  健骨二仙提取液（由龜板膠、鹿角膠、枸杞，人參等藥物按傳統(tǒng)制劑工藝提取而成，制成浸膏，含生藥 L，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供）；倍美力 片（美國藥典標(biāo)準(zhǔn)，由美國惠氏艾爾斯特制藥公司生產(chǎn)，批號：）。  &#

5、160;   試劑  鹽酸四環(huán)素（華美公司分裝，）；熒光染料鈣黃綠素（，上海三愛思試劑有限公司， ）；二丁基鄰苯二甲酸鹽（ ，美國西格瑪公司生產(chǎn)：）；骨染料（ ； ； ； ，美國西格瑪公司生產(chǎn)）。      儀器  低速鋸（美國公司）；半自動圖像數(shù)字化分析儀（包括光鏡和熒光顯微鏡，日本公司）；數(shù)字化板、電腦和形態(tài)學(xué)程序“”體視學(xué)軟件（美國）。      方法      分組與造模  只大鼠隨機(jī)分成組：假手術(shù)組只；單純卵巢切除手術(shù)組（簡稱

6、模型組）只；卵巢切除健骨二仙提取液治療組（簡稱治療組）只；卵巢切除倍美力治療組（簡稱倍美力組）只。用戊巴比妥鈉，按 腹腔麻醉后，備皮無菌條件下從腰椎正中線做 左右皮膚切口，鈍性分離腰椎雙側(cè)肌層進(jìn)入腹腔背側(cè)，完整切除雙側(cè)卵巢后，止血，逐層縫合后，切除卵巢的（即模型組）。以相同方法進(jìn)入腹腔背側(cè)后，切除少許脂肪組織，止血縫合后，為假手術(shù)組。造模后飼養(yǎng)時間為周。      給藥方法  假手術(shù)組及去卵巢組：以生理鹽水每只 每天灌胃次。治療組：按文獻(xiàn)計算，含生藥 以健骨二仙提取液每天灌胃次；倍美力組：按文獻(xiàn)計算，以倍美力 每天灌胃次。給藥干預(yù)治療周。處死前

7、第、天，皮下注射鹽酸四環(huán)素 （·），處死前第、天，皮下注射鈣黃綠素 （·），進(jìn)行骨組織的雙熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)周時采用戊巴比妥鈉麻醉，右心室抽血處死，迅速取右脛骨，用低速鋸將其鋸為段，取脛骨中段，先以橫斷面做較厚的鋸片，然后打磨成 左右厚片；骨形態(tài)計量學(xué)檢測用半自動圖像數(shù)字化儀，測量橫斷面骨組織的各參數(shù)，并據(jù)此得出各計算參數(shù)。      統(tǒng)計學(xué)分析    所有數(shù)據(jù)采用軟件包進(jìn)行方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。        

8、                         結(jié)果      對脛骨中段皮質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響    各組脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)測定切片如圖，參數(shù)結(jié)果詳見表。骨組織總面積，即整個橫斷面面積，代表骨外膜骨形成的情況，骨組織總面積增大表示骨形成增加，反之表示骨形成減少；骨髓腔總面積，反映骨內(nèi)

9、膜面骨吸收與骨形成的情況，“增大”表示骨吸收增加或骨形成減少，“不變化”表示兩者平衡，“縮小”表示骨吸收減少或骨形成增加；皮質(zhì)骨面積，能綜合反映內(nèi)外骨面變化的結(jié)果，還應(yīng)減去皮質(zhì)內(nèi)小孔的面積；皮質(zhì)骨百分率，為皮質(zhì)骨占總面積的百分比，是相對值，意義與骨組織總面積基本一致。    對于骨組織總面積和骨髓腔總面積，模型組較假手術(shù)組均有增加，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（）。另外，實(shí)驗(yàn)觀察到，治療組與模型組相比較，骨髓腔總面積減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（）。其他指標(biāo)以及其他組間的比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異。      對脛骨中段皮質(zhì)骨外膜面骨形態(tài)計量

10、學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響    各組脛骨中段皮質(zhì)骨外膜面骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)測定切片見圖，參數(shù)結(jié)果見表。    對于外膜面骨形成參數(shù)標(biāo)記周長百分率、骨礦化沉積率和骨形成率。模型組較假手術(shù)組均有增加（或），治療組與倍美力組兩組雖較模型組有下降趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)差異，倍美力組外膜面的個骨形成參數(shù)高于假手術(shù)組（），而治療組未見此種改變。      對大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨內(nèi)膜面骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響    各組脛骨中段皮質(zhì)骨內(nèi)膜面骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)測定切片見圖，參數(shù)結(jié)果見表。&

11、#160;   內(nèi)膜面骨形成參數(shù)主要有標(biāo)記周長百分率、骨礦化沉積率和骨形成率。模型組和倍美力組各項骨形成指標(biāo)較假手術(shù)組增高（或），治療組僅骨礦化沉積率較假手術(shù)組升高（）；與模型組相比較，治療組骨形成的三項參數(shù)均有不同程度降低（或），其余各組間對照無統(tǒng)計學(xué)差異。對于內(nèi)膜面骨吸收周長百分率，倍美力組、模型組都較假手術(shù)組升高（或），治療組暫未出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)差異的增高；與模型組相比較，假手術(shù)組、治療組和倍美力組的骨吸收周長百分率都處于較低水平（）。    討論    骨組織形態(tài)計量學(xué)是近年發(fā)展起來的一門體視學(xué)技術(shù)，能定量觀

12、察和研究骨組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)，從組織學(xué)上，對骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)、骨質(zhì)的特征等方面進(jìn)行研究。未脫鈣標(biāo)本的骨組織形態(tài)學(xué)分析，可以把藥物對松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的影響，在組織水平和細(xì)胞水平上做出評價，經(jīng)四環(huán)素和鈣黃綠素等熒光物質(zhì)雙標(biāo)記，還可以對骨礦代謝和骨形成過程進(jìn)行定量分析。    分析本研究的大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)學(xué)參數(shù)結(jié)果，模型組織總面積及骨髓腔總面積均增大，最終表現(xiàn)為皮質(zhì)骨百分率降低，顯示去卵巢后雌激素下降導(dǎo)致的高轉(zhuǎn)換型骨量丟失，雖然不如松質(zhì)骨骨量丟失快速和顯著，亦提示造模在皮質(zhì)骨可以獲得成功。由于皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)致密，與松質(zhì)骨相比較，血管和軟組織少，雌激素受體在皮質(zhì)骨中的表達(dá)水平遠(yuǎn)較

13、松質(zhì)骨低，因此，對去卵巢和藥物干預(yù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)變化在短期內(nèi)不明顯，。此次實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)健骨二仙提取液對控制骨髓腔的擴(kuò)大有一定的治療意義。如果期望在皮質(zhì)骨得到更好的造模效果或取得更好的藥物療效，需要更長的造模時間和藥物治療干預(yù)時間。    通過分析動態(tài)學(xué)參數(shù)結(jié)果，往往可以獲得靜態(tài)學(xué)參數(shù)結(jié)果形成的原因，且通過藥物干預(yù)，皮質(zhì)骨動態(tài)參數(shù)短期內(nèi)仍可能出現(xiàn)某些變化，可以用于觀察骨組織對藥物的反應(yīng)性。綜觀此次實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)為動態(tài)參數(shù)的變化比靜態(tài)參數(shù)變化明顯。動態(tài)學(xué)參數(shù)中，去卵巢組外、內(nèi)膜面的標(biāo)記周長百分率、骨礦化沉積率、骨形成率等骨形成指標(biāo)均升高，內(nèi)膜面骨吸收周長百分率也升高，提示為高轉(zhuǎn)

14、換型皮質(zhì)骨骨量丟失，這與靜態(tài)學(xué)參數(shù)結(jié)果的表現(xiàn)一致，均印證了造模成功。去卵巢后采用健骨二仙提取液進(jìn)行治療干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：健骨二仙提取液對外膜面的骨形成各項參數(shù)均未產(chǎn)生明顯影響，對內(nèi)膜面的骨形成、骨吸收參數(shù)則均有明顯的控制，提示對內(nèi)膜降低骨轉(zhuǎn)換速率有較好的控制，對外膜面的高轉(zhuǎn)換則無明顯效果，因此能控制骨髓腔快速擴(kuò)大，而防止皮質(zhì)骨的骨量流失。去卵巢后采用倍美力治療干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：倍美力對大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨外、內(nèi)膜面的骨形成各項參數(shù)均未明顯控制，對內(nèi)膜面的骨吸收參數(shù)控制則有效，表現(xiàn)與對松質(zhì)骨的影響，不同。相比較，健骨二仙提取液治療組的骨轉(zhuǎn)換水平比倍美力更接近假手術(shù)組水平，考慮與雌激素受體在皮質(zhì)骨中的表達(dá)水平遠(yuǎn)較松質(zhì)骨低，有關(guān)，而健骨二仙提取液的作用機(jī)理則不單純依賴雌激素受體，因此在該實(shí)驗(yàn)周期表現(xiàn)出對皮質(zhì)骨代謝的影響較倍美力強(qiáng)。    健骨二仙提取液通過抑制骨高轉(zhuǎn)換，總體抑制骨吸收大于骨形成，減少了骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)退化，是該藥防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理之一。至于健骨二仙提取液最終能否達(dá)到增加骨強(qiáng)度、防止骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的治療目的，還需要配合生物力學(xué)研究，以及長期臨床觀察該藥對預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  蕭勁夫，朱 海，李 昂，等 益氣補(bǔ)腎法防治原發(fā)