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1、健骨二仙提取液對去卵巢大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨形態(tài)計量學的影響 【摘要】 目的 探討健骨二仙提取液對去卵巢大鼠皮質(zhì)骨形態(tài)計量學的影響,進一步研究該藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機理。方法 將只月齡雌性近交系大鼠隨機分為組:假手術(shù)組、單純?nèi)ヂ殉步M(即模型組)、卵巢切除健骨二仙提取液(即治療組)、卵巢切除倍美力組(即倍
2、美力組),采用去卵巢方法進行骨質(zhì)疏松造模,周后藥物干預治療周,采用皮下注射鹽酸四環(huán)素和鈣黃綠素進行骨表面的雙熒光標記,全部處死大鼠取右脛骨中段不脫鈣骨切片進行骨形態(tài)計量學參數(shù)測定。結(jié)果 與去卵巢組相比較,治療組骨髓腔總面積減?。ǎ饽っ娴墓切纬筛黜梾?shù)均無明顯變化,治療組和倍美力組骨內(nèi)膜面的骨吸收參數(shù)均降低(),治療組內(nèi)膜面骨形成參數(shù)降低(或),使皮質(zhì)骨轉(zhuǎn)換水平比倍美力組更接近假手術(shù)組水平。結(jié)論 健骨二仙提取液可抑制去卵巢后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的形成,總體抑制骨吸收大于骨形成,減少了骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)退化,是該藥防治骨質(zhì)疏松癥的機理之一。 【關(guān)鍵詞】 健骨二仙提取液;原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥;
3、骨形態(tài)計量學;實驗研究;動物;大鼠;龜板膠;鹿角膠;人參 (, , ) : () , () , () () , , , (), , () ( ) , , ; ; ; ; 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種常見的老年性骨代謝疾病,我們采用益氣補腎法治療該病取得較為滿意的臨床療效,并對該藥的作用機理進行了研究及報道。為進一步考察其對骨形態(tài)學的影響,以健骨二仙提取液對去卵巢大鼠進行了脛骨中段皮質(zhì)骨骨形態(tài)計量學研究,現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。 材料與方法
4、 材料 動物 月齡雌性 級近交系大鼠(中國科學院上海實驗動物中心提供,動物合格證號:中科動管第號)只,體質(zhì)量(±)。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心二級動物實驗室(環(huán)境設(shè)施合格證號:)。 藥物 健骨二仙提取液(由龜板膠、鹿角膠、枸杞,人參等藥物按傳統(tǒng)制劑工藝提取而成,制成浸膏,含生藥 L,由廣州中醫(yī)藥大學制劑室提供);倍美力 片(美國藥典標準,由美國惠氏艾爾斯特制藥公司生產(chǎn),批號:)。
5、160; 試劑 鹽酸四環(huán)素(華美公司分裝,);熒光染料鈣黃綠素(,上海三愛思試劑有限公司, );二丁基鄰苯二甲酸鹽( ,美國西格瑪公司生產(chǎn):);骨染料( ; ; ; ,美國西格瑪公司生產(chǎn))。 儀器 低速鋸(美國公司);半自動圖像數(shù)字化分析儀(包括光鏡和熒光顯微鏡,日本公司);數(shù)字化板、電腦和形態(tài)學程序“”體視學軟件(美國)。 方法 分組與造模 只大鼠隨機分成組:假手術(shù)組只;單純卵巢切除手術(shù)組(簡稱
6、模型組)只;卵巢切除健骨二仙提取液治療組(簡稱治療組)只;卵巢切除倍美力治療組(簡稱倍美力組)只。用戊巴比妥鈉,按 腹腔麻醉后,備皮無菌條件下從腰椎正中線做 左右皮膚切口,鈍性分離腰椎雙側(cè)肌層進入腹腔背側(cè),完整切除雙側(cè)卵巢后,止血,逐層縫合后,切除卵巢的(即模型組)。以相同方法進入腹腔背側(cè)后,切除少許脂肪組織,止血縫合后,為假手術(shù)組。造模后飼養(yǎng)時間為周。 給藥方法 假手術(shù)組及去卵巢組:以生理鹽水每只 每天灌胃次。治療組:按文獻計算,含生藥 以健骨二仙提取液每天灌胃次;倍美力組:按文獻計算,以倍美力 每天灌胃次。給藥干預治療周。處死前
7、第、天,皮下注射鹽酸四環(huán)素 (·),處死前第、天,皮下注射鈣黃綠素 (·),進行骨組織的雙熒光標記。實驗周時采用戊巴比妥鈉麻醉,右心室抽血處死,迅速取右脛骨,用低速鋸將其鋸為段,取脛骨中段,先以橫斷面做較厚的鋸片,然后打磨成 左右厚片;骨形態(tài)計量學檢測用半自動圖像數(shù)字化儀,測量橫斷面骨組織的各參數(shù),并據(jù)此得出各計算參數(shù)。 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用軟件包進行方差分析,以均數(shù)±標準差表示。
8、 結(jié)果 對脛骨中段皮質(zhì)骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)的影響 各組脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)測定切片如圖,參數(shù)結(jié)果詳見表。骨組織總面積,即整個橫斷面面積,代表骨外膜骨形成的情況,骨組織總面積增大表示骨形成增加,反之表示骨形成減少;骨髓腔總面積,反映骨內(nèi)
9、膜面骨吸收與骨形成的情況,“增大”表示骨吸收增加或骨形成減少,“不變化”表示兩者平衡,“縮小”表示骨吸收減少或骨形成增加;皮質(zhì)骨面積,能綜合反映內(nèi)外骨面變化的結(jié)果,還應減去皮質(zhì)內(nèi)小孔的面積;皮質(zhì)骨百分率,為皮質(zhì)骨占總面積的百分比,是相對值,意義與骨組織總面積基本一致。 對于骨組織總面積和骨髓腔總面積,模型組較假手術(shù)組均有增加,其差異具有統(tǒng)計學意義()。另外,實驗觀察到,治療組與模型組相比較,骨髓腔總面積減少,差異具有統(tǒng)計學意義()。其他指標以及其他組間的比較,均無統(tǒng)計學差異。 對脛骨中段皮質(zhì)骨外膜面骨形態(tài)計量
10、學動態(tài)參數(shù)的影響 各組脛骨中段皮質(zhì)骨外膜面骨形態(tài)計量學動態(tài)參數(shù)測定切片見圖,參數(shù)結(jié)果見表。 對于外膜面骨形成參數(shù)標記周長百分率、骨礦化沉積率和骨形成率。模型組較假手術(shù)組均有增加(或),治療組與倍美力組兩組雖較模型組有下降趨勢,但未見統(tǒng)計學差異,倍美力組外膜面的個骨形成參數(shù)高于假手術(shù)組(),而治療組未見此種改變。 對大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨內(nèi)膜面骨形態(tài)計量學動態(tài)參數(shù)的影響 各組脛骨中段皮質(zhì)骨內(nèi)膜面骨形態(tài)計量學動態(tài)參數(shù)測定切片見圖,參數(shù)結(jié)果見表。&
11、#160; 內(nèi)膜面骨形成參數(shù)主要有標記周長百分率、骨礦化沉積率和骨形成率。模型組和倍美力組各項骨形成指標較假手術(shù)組增高(或),治療組僅骨礦化沉積率較假手術(shù)組升高();與模型組相比較,治療組骨形成的三項參數(shù)均有不同程度降低(或),其余各組間對照無統(tǒng)計學差異。對于內(nèi)膜面骨吸收周長百分率,倍美力組、模型組都較假手術(shù)組升高(或),治療組暫未出現(xiàn)具有統(tǒng)計學差異的增高;與模型組相比較,假手術(shù)組、治療組和倍美力組的骨吸收周長百分率都處于較低水平()。 討論 骨組織形態(tài)計量學是近年發(fā)展起來的一門體視學技術(shù),能定量觀
12、察和研究骨組織形態(tài)及結(jié)構(gòu),從組織學上,對骨的微細結(jié)構(gòu)、骨質(zhì)的特征等方面進行研究。未脫鈣標本的骨組織形態(tài)學分析,可以把藥物對松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的影響,在組織水平和細胞水平上做出評價,經(jīng)四環(huán)素和鈣黃綠素等熒光物質(zhì)雙標記,還可以對骨礦代謝和骨形成過程進行定量分析。 分析本研究的大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)學參數(shù)結(jié)果,模型組織總面積及骨髓腔總面積均增大,最終表現(xiàn)為皮質(zhì)骨百分率降低,顯示去卵巢后雌激素下降導致的高轉(zhuǎn)換型骨量丟失,雖然不如松質(zhì)骨骨量丟失快速和顯著,亦提示造模在皮質(zhì)骨可以獲得成功。由于皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)致密,與松質(zhì)骨相比較,血管和軟組織少,雌激素受體在皮質(zhì)骨中的表達水平遠較
13、松質(zhì)骨低,因此,對去卵巢和藥物干預誘導的骨質(zhì)變化在短期內(nèi)不明顯,。此次實驗僅發(fā)現(xiàn)健骨二仙提取液對控制骨髓腔的擴大有一定的治療意義。如果期望在皮質(zhì)骨得到更好的造模效果或取得更好的藥物療效,需要更長的造模時間和藥物治療干預時間。 通過分析動態(tài)學參數(shù)結(jié)果,往往可以獲得靜態(tài)學參數(shù)結(jié)果形成的原因,且通過藥物干預,皮質(zhì)骨動態(tài)參數(shù)短期內(nèi)仍可能出現(xiàn)某些變化,可以用于觀察骨組織對藥物的反應性。綜觀此次實驗也表現(xiàn)為動態(tài)參數(shù)的變化比靜態(tài)參數(shù)變化明顯。動態(tài)學參數(shù)中,去卵巢組外、內(nèi)膜面的標記周長百分率、骨礦化沉積率、骨形成率等骨形成指標均升高,內(nèi)膜面骨吸收周長百分率也升高,提示為高轉(zhuǎn)
14、換型皮質(zhì)骨骨量丟失,這與靜態(tài)學參數(shù)結(jié)果的表現(xiàn)一致,均印證了造模成功。去卵巢后采用健骨二仙提取液進行治療干預,實驗結(jié)果提示:健骨二仙提取液對外膜面的骨形成各項參數(shù)均未產(chǎn)生明顯影響,對內(nèi)膜面的骨形成、骨吸收參數(shù)則均有明顯的控制,提示對內(nèi)膜降低骨轉(zhuǎn)換速率有較好的控制,對外膜面的高轉(zhuǎn)換則無明顯效果,因此能控制骨髓腔快速擴大,而防止皮質(zhì)骨的骨量流失。去卵巢后采用倍美力治療干預,實驗結(jié)果提示:倍美力對大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨外、內(nèi)膜面的骨形成各項參數(shù)均未明顯控制,對內(nèi)膜面的骨吸收參數(shù)控制則有效,表現(xiàn)與對松質(zhì)骨的影響,不同。相比較,健骨二仙提取液治療組的骨轉(zhuǎn)換水平比倍美力更接近假手術(shù)組水平,考慮與雌激素受體在皮質(zhì)骨中的表達水平遠較松質(zhì)骨低,有關(guān),而健骨二仙提取液的作用機理則不單純依賴雌激素受體,因此在該實驗周期表現(xiàn)出對皮質(zhì)骨代謝的影響較倍美力強。 健骨二仙提取液通過抑制骨高轉(zhuǎn)換,總體抑制骨吸收大于骨形成,減少了骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)退化,是該藥防治骨質(zhì)疏松癥的機理之一。至于健骨二仙提取液最終能否達到增加骨強度、防止骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的治療目的,還需要配合生物力學研究,以及長期臨床觀察該藥對預防骨質(zhì)疏松性骨折的作用?!緟⒖嘉墨I】 蕭勁夫,朱 海,李 昂,等 益氣補腎法防治原發(fā)
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