人類角膜緣干細(xì)胞對(duì)外周血淋巴細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、人類角膜緣干細(xì)胞對(duì)外周血淋巴細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)關(guān)鍵詞：人類角膜 【摘要】目的觀察體外培養(yǎng)的人類角膜緣干細(xì)胞對(duì)同種異體外周血淋巴細(xì)胞的作用。方法通過(guò)植片技術(shù)分離人角膜上皮細(xì)胞以及角膜緣干細(xì)胞。在兩種細(xì)胞單層上，觀察同種異體外周血淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刀豆蛋白（ConA）的增殖反應(yīng)。另外，將兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清直接轉(zhuǎn)移到由Con刺激的淋巴細(xì)胞增殖系統(tǒng)，以觀察兩種細(xì)胞釋放某些因子的抑制效應(yīng)。結(jié)果單層角膜緣干細(xì)胞對(duì)Con刺激的外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)可以施加有效的抑制效應(yīng)。角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)Con刺激的外周血淋巴細(xì)胞增殖系統(tǒng)，在72h分離上清顯示有明顯抑制效應(yīng)。結(jié)論角膜緣干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞交互作用和（或）釋

2、放某些抑制性因子對(duì)淋巴細(xì)胞的活化和增殖發(fā)揮潛在的抑制作用。 【關(guān)鍵詞】角膜上皮細(xì)胞;角膜緣干細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng) Studiesonthekeratolimbalstemcelltothepericirculationlymphocyteactivationandproliferation 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheregulationofhostlymphocyteactivationbytheallograftoflimbalstemcells.MethodsLimbalstemcellsandthecornealepithelialcellswere

3、culturedandisolatedfromhumancorneasbyexplanttechnique.Themediumsofeachcellsweregatheredtimeandwerefreezeatdifferenttimein-20afterpurification.LymphocytesoftheotherbodywereculturedinmediumsstimulatedbyConA.Limbalstemcellsorthecornealepithelialcellsofthehumanwereco-culturedwiththelymphocytesfromtheoth

4、erbodysblood.LymphocyteproliferationassaywasassessedbyMTTcolorimetricdetermination.ResultsSignificantproliferationofthelymphocyteswasshownafteraddingtheConA.Thegatheredsupernatantofthe72heitherfromthelimbalstemcellsorthecornealepithelialcellswasshownapotentinhibitoryeffectofthelymphocytesproliferati

5、on.Themonolayerdomesticrabbitslimbalstemcells,showedasignificantsuppressiveeffectontheallograftlymphocytesproliferationaftermixedlymphocyteculturefor48h,butthisphenomenoncouldntbeseeninthemonolayercornealepitheliuminvitro.ConclusionTheresultsshowthattherewouldbealotofpossiblemechanismsthatworkedinde

6、pendentlyorworkedinconcerttoinhibitthelymphocytesproliferation,butmainlybycell-cellinteractionand/orsomeothersolublefactors,andlimbalstemcellswouldtakearoleonraisingtheeyeimmunity. 【Keywords】cornealepithelium;limbalstemcell;cellculture 在比較聯(lián)合角膜緣的穿透性角膜移植與單純大植片角膜移植的術(shù)后植片存活率的比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，前者的排斥反應(yīng)發(fā)生率低1，2，其機(jī)制尚未見(jiàn)研究

7、報(bào)道，是否因?yàn)榻悄ぞ壐杉?xì)胞有抑制淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，亦尚無(wú)此方面研究報(bào)道，我們前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)兔角膜緣干細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞交互作用和（或）釋放某些抑制性因子抑制同種異體兔淋巴細(xì)胞的活化和增殖3。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察人類同種異體角膜緣干細(xì)胞對(duì)宿主淋巴細(xì)胞活化和增殖的調(diào)節(jié)效應(yīng)，并進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)角度證實(shí)角膜緣干細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞相比在引起同種異體排斥反應(yīng)中的作用。 1材料與方法 1.1人角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的制備在無(wú)菌條件下取新鮮人角膜，將角膜分為中央和角膜緣組織，去除角膜內(nèi)皮細(xì)胞以及后2/3角膜板層后，將組織切成1mm2mm，上皮細(xì)胞面向下置于12孔培養(yǎng)板中，每孔有3塊組織。加入少量完全細(xì)胞

8、培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1ml雙抗），切勿使組織塊漂浮。在37體積分?jǐn)?shù)為5%CO2和95%空氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基每1天更換1次，6天去除接種組織塊。當(dāng)細(xì)胞形成單層達(dá)70%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA液（12）消化傳代。在12孔板選擇生長(zhǎng)良好匯合的傳代細(xì)胞。在12h內(nèi)使用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基換液3次以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，每孔加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)，每24h收集上清1次，共收集5次。2000/min離心10min，取上清液，去除細(xì)胞碎屑，加入1g/L質(zhì)量濃度牛血清白蛋白（FBS）。使用3.47m分子截流量透析袋透析濃縮2

9、5倍，-20凍存。 1.2ConA誘導(dǎo)的同種異體人外周血淋巴細(xì)胞的增殖取同種異體人外周血3ml，先用PBS液等量稀釋，在緩慢加入3ml的淋巴細(xì)胞分離液（上海第一生物制品所研制）。20密度梯度離心（2000/min20min）后，取出分離好的單核細(xì)胞層，用PBS沖洗2次后，加入4ml完全培養(yǎng)基，打勻細(xì)胞后，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至5109個(gè)/L，使用96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞100l，并分別加入各個(gè)時(shí)間段所取的角膜上皮細(xì)胞或角膜緣干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基50l，各作6個(gè)復(fù)孔。設(shè)立各組的平行對(duì)照組，每孔加入ConA（concanavalinA，C2631,Sigma）至終濃度為2.5mg/L。5ml/LCO2

10、，37培養(yǎng)48h。用四甲基偶氮唑鹽比色分析法（MTT法）4測(cè)定所誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化：各孔加入MTT（5mg/ml）20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，低溫密度梯度離心（4，3000/min離心10min），小心吸出全部上清，采用MTT法，每孔加入MTT溶解液100l，微量振蕩器震蕩30min，使MTT還原產(chǎn)物甲月替（formazan）完全溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定540nm光密度值（OD）。 1.3混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixedlymphocytereaction,MLR）5分別將人角膜上皮細(xì)胞以及角膜緣干細(xì)胞（反應(yīng)細(xì)胞）和同種異體人外周血淋巴細(xì)胞（刺激細(xì)胞），等量細(xì)胞濃度（0.5109個(gè)/L）混合。使用96孔板，每孔

11、加反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞各100l。37孵育48h，用MTT比色分析法測(cè)定所誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值。 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件，將各組所測(cè)的OD值進(jìn)行單因素方差分析，比較組間差異。P0.05為差異有顯著性，P0.01為差異有極顯著性。 2結(jié)果 2.1人角膜緣干細(xì)胞對(duì)絲裂原激活同種異體外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用在ConA存在下，人外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生顯著的增殖效應(yīng)。但將ConA加人外周血淋巴細(xì)胞在同種異體角膜緣干細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間段的條件培養(yǎng)基中共育時(shí)，72h收集的不論是角膜緣干細(xì)胞或是角膜上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基均對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的增殖有顯著性抑制作用（P0.01）

12、（見(jiàn)圖1）。 2.2與人角膜緣干細(xì)胞共育對(duì)同種異體外周血淋巴細(xì)胞活性的影響分別將角膜緣干細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞與等量的同種異體外周血淋巴細(xì)胞共育48h，角膜緣干細(xì)胞顯著減弱同種異體人外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P0.01）（見(jiàn)圖2）。 2.3角膜上皮細(xì)胞對(duì)外周血淋巴細(xì)胞活性的影響在角膜上皮細(xì)胞存在時(shí)，同種異體人外周血淋巴細(xì)胞活性未見(jiàn)明顯受抑制，但角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)的72h上清對(duì)外周血淋巴細(xì)胞有顯著抑制效應(yīng)（見(jiàn)圖1、2）。圖1淋巴細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞及角膜緣圖2角膜緣干細(xì)胞以及角膜上皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng) 2.4角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)與角膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)相比，角膜緣干細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于角膜上皮細(xì)胞，培養(yǎng)

13、第3天，可見(jiàn)大量正在分裂的細(xì)胞（見(jiàn)圖3），培養(yǎng)第7天角膜緣干細(xì)胞增生分化出的上皮細(xì)胞已呈片狀布滿整個(gè)培養(yǎng)孔。圖3角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng) 3討論 綜合所述，可以得到以下推論：（1）角膜上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子有抑制同種異體外周血淋巴細(xì)胞的作用，但是將單層角膜上皮與外周血淋巴細(xì)胞共育以上作用就顯著下降；（2）角膜緣干細(xì)胞可分泌抑制同種異體外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子，并且在形成角膜緣干細(xì)胞單層后，這種對(duì)同種異體外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)；（3）角膜緣干細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，在72h產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子對(duì)抑制外周血淋巴細(xì)胞增殖作用最顯著。 以上推論提示：角膜緣干細(xì)胞除了具有在角膜移植術(shù)后提供角膜上皮生

14、長(zhǎng)源泉從而降低排斥發(fā)生的作用外，還可能通過(guò)下述2條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑制免疫排斥反應(yīng)的作用：（1）釋放可溶性細(xì)胞因子；（2）通過(guò)細(xì)胞膜相關(guān)的抑制因子或細(xì)胞通訊。已證實(shí)在培養(yǎng)狀態(tài)下角膜緣干細(xì)胞可表達(dá)IGF-1(insulin-likegrowthfactortype1)、TGF-1、TGF-2、LIF（leukemiainhibitoryfactor）、bFGF及其相關(guān)受體6。目前已研究發(fā)現(xiàn)在治療由于干細(xì)胞缺乏所致的眼表疾病中，角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)明顯提高了單純行部分穿透角膜移植的手術(shù)成功率。這一現(xiàn)象表明了干細(xì)胞對(duì)維持角膜處于相對(duì)免疫赦免狀態(tài)起著重要作用7，8。但是目前尚未見(jiàn)對(duì)角膜緣干細(xì)胞免疫原性的研究

15、報(bào)道，并已證實(shí)角膜緣干細(xì)胞具有屏障功能，可顯著阻礙新生血管的長(zhǎng)入9，但是角膜緣干細(xì)胞是否具有阻礙外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)入的功能尚未得到證實(shí)。 我們的研究表明，角膜緣干細(xì)胞可能通過(guò)釋放可溶性細(xì)胞因子以及細(xì)胞間通訊來(lái)有效地阻礙同種異體外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)入的功能。該作用尚未見(jiàn)其他研究報(bào)道證實(shí)。角膜緣干細(xì)胞移植是否通過(guò)阻礙同種異體外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)入而提高高危移植的成功率尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1洪榮照,吳護(hù)平,王印其,等.角膜緣移植聯(lián)合穿透性角膜移植的臨床觀察.眼科,1998,7(4):224. 2龔向明,劉紅山,鐘興武,等.角膜緣上皮移植聯(lián)合角膜移植治療眼化學(xué)燒傷.中國(guó)實(shí)用眼科雜志,199

16、8,16(8):472. 3鄧宏偉，李辰，陳建蘇,等.角膜緣干細(xì)胞對(duì)外周血淋巴細(xì)胞活化和增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究.眼科研究,2003，21（3）：261-263. 4MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.JImmunologicalMethods,1983,65:55. 5ColiganJE,KruisbeekAM,MargululiesDH,etal.Currentprotocolsinimmunology.NewYork

17、:GreenePublishinGandWileyInterScience,1991,3-12. 6LiDQ,TsengSCG.Threepatternsofcytokineexpressionpotentiallyinvolvedinepithelial-fibroblastinteractionsofhumanocularsurface.JCellPhysiol,1995,163:61. 7HollandEJ,DjalilianAR,SchwartzGS.Managementofaniridickeratopathywithkeratolimbalallograft:alimbalstemcelltransplantationtechnique.Ophthalmology,2003,110(1):125-130. 8