甲氧滴滴涕對小鼠顆粒細胞的毒性損傷及其卵巢組織線粒體的氧化應(yīng)

1、甲氧滴滴涕對小鼠顆粒細胞的毒性損傷及其卵巢組織線粒體的氧化應(yīng)激機制         08-10-11 15:50:00     編輯：studa20               作者：王博，陳必良，馬向東，馬佳佳  【摘要】  目的： 觀察甲氧滴滴涕（MXC）對雌性小鼠顆粒細胞的毒性損傷及其卵巢組織的氧化應(yīng)激機制. 方

2、法： 將40只雌性昆明小鼠隨機分為16,32,64mg/(kg·d)組及溶劑芝麻油組（對照組），連續(xù)20天經(jīng)腹腔注射染毒MXC，末次注射MXC24 h 內(nèi)處死小鼠，TUNEL法、透射電鏡觀察卵巢顆粒細胞凋亡情況；激光共聚焦顯微鏡檢測小鼠卵巢線粒體活性氧簇(ROS)、線粒體膜電勢，紫外分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性變化. 結(jié)果： TUNEL法顯示32,64 mg/kg組凋亡細胞數(shù)(40.87±3.31),（47.12±7.20 ）較16 mg/kg組(14.00±1.85) 及對照組（13.25±1.67）增加，電鏡下見凋亡小體等典型凋亡形

3、態(tài)學改變，卵巢組織線粒體膜電勢，呼吸鏈復(fù)合物活性在32,64 mg/(kg·d)組低于對照組（P<0.01），線粒體ROS水平則較對照組增高（P<0.01）. 結(jié)論： MXC可以通過引起卵巢組織的氧化應(yīng)激誘導顆粒細胞凋亡發(fā)揮其促進卵泡閉鎖的毒性作用. 【關(guān)鍵詞】  甲氧氯 顆粒細胞 細胞凋亡 線粒體 氧化性應(yīng)激【Abstract】AIM: To investigate the toxic damage of methoxychlor(MXC) on mice granulosa cells and the mechanism of oxidative stres

4、s in the ovary tissue. METHODS: MXC was administrated to the 39-day female mice at doses of 0 (control),16,32 and 64 mg/(kg·d) via intraperitoneal injection for consecutive 20 d,then mice were euthanized in estrous. The apoptosis of granulosa cell was observed by TUNEL and transmission electron

5、 microscope. The generation of reactive oxygen species(ROS) and the mitochondrial membrane potential of mouse ovary were detected by laser confocal microscope and the activity of respiratory chain complex of mitochondria was measured by an ultraviolet spectrophotometer. RESULTS: The number of apopto

6、tic cells in 32 and 64 mg/(kg·d) groups was obviously higher(40.87±3.31),（47.12±7.20） than that in 16 mg/(kg·d) (14.00±1.85) and control groups（13.25±1.67,P<0.01).  The transmission electron microscopy showed the apoptosis body in 64 mg/(kg·d) group. 

7、The activity of complex and the membrane potential of mitochondria were significantly lower in 32 and 64 mg/(kg·d) groups when compared to 16 mg/(kg·d) and control groups（P<0.01）,while the ROS was increased in 32 and 64 mg/(kg·d) groups compared with 16 mg/(kg·d) and control g

8、roups（P<0.01）. CONCLUSION: MXC could cause oxidative stress in mitochondria of mouse ovary,which may induce the apoptosis of granulosa cells,and finally follicular atresia.【Keywords】 methoxychlor; granulosa cells; apoptosis; mitochondria; oxidative stress0   引言    甲氧滴滴涕(M

9、XC)是一種替代滴滴涕的有機氯殺蟲劑,體內(nèi)外研究證實甲氧滴滴涕能夠引起雌性大鼠動情周期延長1，卵巢萎縮，卵泡閉鎖以及降低卵巢組織細胞合成和分泌類固醇激素的能力2-3,另有研究表明卵泡閉鎖過程中發(fā)生的顆粒細胞凋亡通常也可以由氧化應(yīng)激引起，且這種凋亡可以被超氧化物岐化酶（SOD）、抗壞血酸等氧化應(yīng)激抑制劑所阻斷4. 本次實驗擬通過對雌性小鼠腹腔染毒MXC,觀察其對卵巢組織線粒體氧化應(yīng)激及顆粒細胞凋亡的影響，探討MXC對卵巢組織毒性作用的可能機制.1   材料和方法1.1   材料   動物： 32日齡雌性昆明小鼠20只購于第四軍醫(yī)大學實驗

10、動物中心，體質(zhì)量3238 g，自由飲食，飼養(yǎng)溫度(22±1)，12 h光照黑暗交替. 經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機分為對照組,MXC 每日16,32,64 mg/kg 4組，每組5只. 自小鼠39日齡起每日腹腔注射MXC染毒，連續(xù)20 d3,5. 試劑與儀器：MXC購自美國Sigma公司（純度99，編號：49054），芝麻油為市售純正芝麻油；甘露醇、蔗糖、EDTA、HEPES及triton X-100均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司，Bradford蛋白定量試劑盒及活性氧檢測試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)公司，Rh123、NADH購于碧云天生物技術(shù)研究所，TUNEL凋亡檢測試劑盒購自Ro

11、che公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純. 臺式低溫高速離心機(Saitexiangyi tgl-20M),紫外-可見分光光度計（日本島津UV-2450），激光共聚焦顯微鏡（奧林巴司,FV-1000），熒光顯微鏡（Nikon,E-1000）透射電子顯微鏡（HITACHI公司,H-600）.1.2 方法1.2.1   顆粒細胞凋亡的檢測   末次注射MXC后24 h內(nèi)脫頸處死小鼠，迅速取出小鼠卵巢，經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定、石蠟包埋制成組織切片后，按照TUNEL凋亡試劑盒說明進行顆粒細胞的凋亡檢測，結(jié)果以熒光顯微鏡觀察并照片，參照文獻6進行凋亡細胞計數(shù)6. 透射

12、電鏡觀察顆粒細胞的超微結(jié)構(gòu).1.2.2   卵巢組織線粒體的提取   動物分組及染毒同前,每組5只小鼠待卵巢取出后迅速置于預(yù)冷的0左右的線粒體提取緩沖液中（225 mmol/L甘露醇，75 mmol/L蔗糖，0.2 mmol/LEDTA,pH7.4）,以眼科剪剪碎后倒入玻璃勻漿器中，上下研磨數(shù)十次，制成卵巢組織勻漿并于4,700 g離心10 min棄沉淀以去除細胞核、未破碎細胞及非亞細胞組織，上清于7000 g離心20 min后取沉淀并將其懸浮于提取緩沖液中，繼續(xù)以7000 g離心20 min，重復(fù)兩次，終沉淀經(jīng)詹納斯綠B檢驗為純化的線粒體7，以上操作均

13、在04下進行. Bradford蛋白定量試劑盒檢測線粒體蛋白濃度，并將其濃度調(diào)整為1 mg/mL. 用于測定呼吸鏈復(fù)合體的線粒體蛋白懸液分裝后-70 保存,保存時間不超過3 d；線粒體膜電勢及活性氧簇的檢測則在提取線粒體后立刻進行.1.2.3   線粒體膜電勢的檢測   將提取出的線粒體10 L與170L的測定緩沖液（測定緩沖液的組成為： 15 mmol/L蔗糖,5 mmol/L MgCl2,5 mmol/L琥珀酸鈉,5mmol/L K2HPO4，20 mmol/L HEPES，pH7.4）混合加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，并加入20 L Rh123(100 g/

14、mL)至每孔終體積為200 L，室溫下避光孵育30 min. 以激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長538 nm處檢測各反應(yīng)混合物熒光強度的變化8-9. 當膜電勢水平較高時，Rh123將發(fā)生淬滅；反之，Rh123在膜電勢水平較低時會從線粒體內(nèi)釋放，熒光強度增加，即低水平的膜電勢對應(yīng)較高的Rh123的熒光強度.1.2.4   線粒體活性氧簇（ROS）的檢測   取10 L線粒體與170 LHEPES緩沖液緩沖液的組成為（mmol/L）:NaCl,120; KCl,2.5;NaH2PO4,1.2; MgCl2,0.1; NaHCO3,5.0;葡萄糖,6.0;CaCl2,1.0;HEPES,10 at pH7.4共同加入96孔培養(yǎng)板中，并加入20 L DCFH-DA (100 mol/L)至每孔終體積200 L，37避光孵育30 min. 在激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長530 nm處以激光共聚焦顯微鏡記錄各孔的熒光強度，熒光強度與活性氧水平成正比，增加的熒光強度即被認為是增加的活