引物純化方式選擇指南

1、引物純化方式選擇指南2012-2-1610:24:14內(nèi)容導(dǎo)讀DNA合成的方法和原理二、引物純化的方法原理及其效果三、純化方法與應(yīng)用指南四、常見問題的原因分析及相應(yīng)的對(duì)策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行?；谠摲椒ǖ腄NA合成儀有多種，由ABI/PE公司生產(chǎn)的高通量DNA自動(dòng)合成儀得到了廣泛的應(yīng)用。各合成儀進(jìn)行引物合成的原理基本相同，主要區(qū)別在于合成產(chǎn)率的高低、試劑消耗量和單個(gè)循環(huán)用時(shí)等。生工公司采用的合成儀主要機(jī)型為全新的ABI3900高通量合成儀。固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。該方法是在固相載體上完成D

2、NA鏈的合成的，DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過程從5'-3'方向延伸，而是由3'端開始，相鄰的核音酸通過3'f韓酸二酯鍵連接。具體的反應(yīng)步驟如圖一。1 、脫保護(hù)基(Deblocking)用三氯乙酸(TrichloroaceticAcid，TCA)脫去連結(jié)在CPG(ControlledPoreGlass)上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5'-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。2 、活化(Activation)將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其3'-端已被活化，但5&#

3、39;-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與GPG上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。3 、連接(Coupling)亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5'-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基。4、封閉(Capping)縮合反應(yīng)后，為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5'-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙?；瘉矸忾]此端羥基，一般乙酰化試劑是用乙酸酊和N-甲基咪嘎等混合形成的。圖1:DNA合成原理示意圖(固相亞磷酰胺三酯法)5、氧化(Oxidation)縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而

4、亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基，合成的Oligo在脫去保護(hù)基后，目的Oligo純度是比較低的，其中含有大量的雜質(zhì)。主要雜質(zhì)有：所脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時(shí)產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長(zhǎng)OligoDNA含量?jī)H為25%左右。盡管合成時(shí)每一步的效率都在98%99

5、%,但累積的效率并不高。這些雜質(zhì)成分，尤其是存在于粗產(chǎn)品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會(huì)影響下一步的反應(yīng)。因此必須對(duì)OligoDNA進(jìn)行純化、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。二、引物純化的方法原理及其效果基于以上合成的原理和步驟，目前，常見的幾種純化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。生工公司采用HAP、ULTRAPAGE、HPLC三種純化方法，其純化的原理及其效果分別如下，我們建議客戶應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適、經(jīng)濟(jì)并有效的純化方法。1. HAP純化方法HAP（HighAffinityPurification）是生工生物自主開發(fā)的新型oligo

6、DNA純化方法。該方法已取得國家專利（專利號(hào)：200310208040.X）。其原理是利用合成引物5'-端DMT基團(tuán)對(duì)HAP樹脂專一性吸附，而不含DMT的短鏈DNA不被吸附，從而達(dá)到分離純化的目的。HAP純化柱中裝有對(duì)DMT具有親和力的樹脂，合成DNA片段時(shí)保留5'端最后一個(gè)堿基上的DMT，所有合成產(chǎn)物吸附在柱上以后，用稀的有機(jī)溶劑洗柱，帶有DMT的片段吸附能力強(qiáng)，不易被洗脫，不帶有DMT的片段吸附能力弱，被洗脫。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脫去DMT基團(tuán)，再用濃一點(diǎn)的有機(jī)溶劑洗脫DNA。這種方法具有多快好省的特點(diǎn)。制品純度可達(dá)到8090%，可以滿足雜交探針、測(cè)序、常規(guī)

7、PCR（不再做進(jìn)一步克隆實(shí)驗(yàn)）等用途了。但是因?yàn)槠鋵Ｒ恍晕紻MT能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負(fù)載量小。特別是對(duì)長(zhǎng)于39堿基以上的片段純化效果不好。此級(jí)別只提供長(zhǎng)度在10-39mer以下的合成oligoDNA制品。序列更長(zhǎng)時(shí)，制品的純度得不到保證。若考慮節(jié)約經(jīng)費(fèi)，對(duì)于要求較低的實(shí)驗(yàn)，如簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)，則采用HAP純化即可。2. ULTRAPAGE純化方法PAGE（PolyacrylamideGelElectrophoresis），該方法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化基于尺寸和構(gòu)象分離全長(zhǎng)產(chǎn)物和失敗序列，可以分離

8、相差一個(gè)堿基的引物（120堿基以內(nèi)），從而提供高純度的引物。純化后的DNA純度大于90%，相比與其他兩種方法，PAGE純化對(duì)長(zhǎng)鏈OligoDNA（大于50mer）的純化特別有效，制品純度保證9095%。如訂購的DNA欲用作RT-PCR引物、各種探針，或用于PCR克隆測(cè)序、定點(diǎn)突變等，請(qǐng)選用PAGE純化制品。ULTRAPAGE:理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。經(jīng)過PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶往往比較寬，帶與帶之間有重疊，分辨率有所下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬，很難避免割到差別僅一個(gè)或幾個(gè)

9、堿基的引物。因此生工生物為了給客戶更好解決以上問題，將原有的PAGE純化方式升級(jí)優(yōu)化為現(xiàn)在的ULTRAPAGE純化方式，即在PAGE純化的同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì)DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。3. HPLC純化方法HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography）是使用高效液相色譜的原理，依據(jù)DNA的疏水性來分離產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同長(zhǎng)度的DNA片段的疏水性不同，一般來說較長(zhǎng)的片段具有較強(qiáng)的疏水性，AT含量高的片段也具有較強(qiáng)的疏水性。先將粗產(chǎn)物檢測(cè)主峰位置，再增加加樣量，回收主峰位置的部分。該方法用于分離純化時(shí)能達(dá)到很高的純度和靈敏度，可以有效的去除大部分

10、N-短片段，因而可以除去失敗序列或未結(jié)合的標(biāo)記物，從而對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì)DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。由于HPLC產(chǎn)品的純度非常高，使用本法純化的DNA制品可適用于各種基因工程實(shí)驗(yàn)。主要用于PCR克隆、定點(diǎn)突變、人工合成基因、長(zhǎng)鏈和修飾引物的純化等。它的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化程度高、省人力；弱點(diǎn)是純化量通量小、成本較高。三、純化方法與應(yīng)用指南表1:HAP、ULTRAPAGE和HPLC三種純化方法的特點(diǎn)比較純化方式純化原理優(yōu)缺點(diǎn)應(yīng)用HAP采用純化柱上特異性樹脂對(duì)DNA片段上保留5'端最后一個(gè)堿基上的DMT有親和吸附作用從而達(dá)到分離純化。多快好省的特點(diǎn)。純度可達(dá)到80

11、90%,但是對(duì)長(zhǎng)于40堿基以上的片段純化效果不好?？梢詽M足雜交探針、測(cè)序、常規(guī)PCR（不再做進(jìn)一步克隆實(shí)驗(yàn)）等用途。ULTRAPAGE采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，基于凝膠的尺寸和DNA的構(gòu)象原理，可以分離相差一個(gè)堿基的引物，從而達(dá)到對(duì)全長(zhǎng)產(chǎn)物和失敗序列進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA,同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì)DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。純度好，準(zhǔn)確性高，對(duì)于較長(zhǎng)序列（40-120）,制品純度保證9095%,相比與其他兩種方法，ULTRAPAGE純化對(duì)長(zhǎng)鏈引物（大于50mer）的純化特別有效，缺點(diǎn)需要跑電泳并切膠回收，費(fèi)時(shí)費(fèi)力?？蛇m于多重PCR、亞克隆、點(diǎn)突變、各種探針，或用于PCR克

12、隆測(cè)序、定點(diǎn)突變等。采用高效液相色譜的原理，依據(jù)DNA的疏水性來分離產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同長(zhǎng)度的DNA片段的疏水HPLC性不同，一般來說較長(zhǎng)的片段具有較強(qiáng)的疏水性，同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì)DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。該法自動(dòng)化程度高、省人力； 對(duì)于較長(zhǎng)片段（大于89 mer）, 純化效果不如 ULTRA PAGE 方法好。盡管對(duì)于較長(zhǎng)序列， 但如果實(shí)驗(yàn)對(duì)制品的純度要 求非常高， HPLC 與ULTRA PAGE雙重精制會(huì)使效果更 佳，其弱點(diǎn)是純化通量小、成 本較高。因其HPLC產(chǎn)品的 純度非常高，使用 本法純化的 DNA 制品可適用于各 種基因工程實(shí)驗(yàn)。 主要用于PCR克 隆、定點(diǎn)突變

13、、人 工合成基因、長(zhǎng)鏈 和修飾引物的純 化。對(duì)40mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法，其次是ULTRAPAGE；而對(duì)40mer以上的DNA制品ULTRAPAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對(duì)PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序，一定要選擇ULTRAPAGE純化或HPLC純化的引物。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，您可以選用以下適合的純化方法，具體見表2表2:HAP、ULTRAPAGE和HPLC三種純化方法的應(yīng)用應(yīng)用引物長(zhǎng)度要求純化方法要求普通PCR/RT-PCR<40baseHAP普通PCR/RT-PCR>40baseULTRAPAGE-PCR/PCR根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRAPAG

14、E,HPLC測(cè)序根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP診斷PCR擴(kuò)增根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP,ULTRAPAGE亞克隆，點(diǎn)突變根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRAPAGE,HPLC基因構(gòu)建根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRAPAGE,HPLC全基因合成根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP反義核酸根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HPLC修飾/標(biāo)記引物根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HPLCPCR產(chǎn)物用于克隆表達(dá)研究或基因重組等根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRAPAGE,HPLC四、常見問題的原因分析及相應(yīng)的對(duì)策Q-1.拿到引物后，想在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)純度，如何實(shí)現(xiàn)？A-1:實(shí)驗(yàn)室可通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行引物純度的檢測(cè)：使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，堿基數(shù)<12個(gè)的引物用20%的膠

15、，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，>60個(gè)堿基的引物用12%的膠。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95C,2min）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后（約2-3小時(shí)），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的（有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì)有條帶，是引物二級(jí)結(jié)構(gòu)條帶)Q-2.測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變或缺失是什么原因？A-2:測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)有突變，主要考慮三個(gè)方面的原因：測(cè)序，PCR/克隆過程，引物本身。A、測(cè)序引入的錯(cuò)誤對(duì)于PCR產(chǎn)物進(jìn)行的

16、克隆而言，無論是TA克隆或酶切克隆，引物區(qū)往往位于載體兩端，如果用載體引物進(jìn)行測(cè)序，此時(shí)克隆引物區(qū)離測(cè)序引物區(qū)的距離比較近，處于測(cè)序起始階段或正好處于測(cè)序染料峰所在的區(qū)域內(nèi)(90-120bp)，這兩個(gè)區(qū)域也是最容易產(chǎn)生測(cè)序錯(cuò)誤的地方。因此，首先要看原始的測(cè)序峰圖在引物區(qū)內(nèi)是否清晰，堿基的錯(cuò)誤或缺失是否是由于峰圖不清楚而導(dǎo)致的計(jì)算機(jī)誤讀。8、 PCR/克隆過程盡管使用高保真聚合酶進(jìn)行PCR出錯(cuò)的可能性比較少，但不排除PCR錯(cuò)配或者克隆過程中突變的可能。有的人會(huì)問，PCR的突變?cè)趺磿?huì)出現(xiàn)在引物區(qū)呢？這是因?yàn)?，引物是單鏈，PCR產(chǎn)物引物區(qū)的互補(bǔ)鏈同樣是以引物為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的，因此，有可能存在引物

17、正確但其產(chǎn)物出錯(cuò)的情況。針對(duì)這種情況的解決方法是進(jìn)行測(cè)序時(shí)，請(qǐng)送2-3個(gè)獨(dú)立的克隆子進(jìn)行測(cè)序，這樣可以排除PCR過程出錯(cuò)或克隆產(chǎn)生突變的情況。C、引物本身錯(cuò)誤如前面所述，引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，即使每一步合成效率達(dá)到99%，仍有1%的序列不能連接或錯(cuò)誤地連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；對(duì)于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中測(cè)序發(fā)現(xiàn)的較常見堿基缺失的可能原因如下：1. 由于DNA合成

18、是沿著3'-5端方向?qū)A基逐個(gè)連接上去的，每連上一個(gè)堿基，都需要經(jīng)過(Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)一個(gè)循環(huán)。Coupling是上一個(gè)堿基的5'-OH與下一個(gè)堿基的3'活性部分發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)的效率最高可達(dá)99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；2. Capping是將沒有連接上下一個(gè)堿基的5'-OH乙?；?，Capping的效率不可能達(dá)到100%，沒有被乙酰化的5'OH會(huì)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；3. Detrit

19、ylation是脫掉上一個(gè)堿基5'-OH上的保護(hù)基，準(zhǔn)備連接下一個(gè)新堿基，Detritylation的效率也不可能達(dá)到100%，沒有脫保護(hù)的5'-OH會(huì)跳過該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列；至于插入突變，引物序列中往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分堿基發(fā)生丟失DMT，處于活性狀態(tài)的新堿基在沒有與上一個(gè)堿基反應(yīng)前發(fā)生自連，將會(huì)造成堿基重復(fù)，故會(huì)發(fā)生插入同一堿基的突變的失敗序列。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，通常發(fā)生在G轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體2,6-

20、diaminopurine（脫嘌呤），DNA復(fù)制和PCR過程中DNA聚合酶將2,6-diaminopurine看作堿基A,發(fā)生G到A的轉(zhuǎn)換，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫喋吟現(xiàn)象在富含喋吟的引物中發(fā)生的頻率較高。引物合成過程中，造成堿基缺失，插入，置換突變的因素客觀存在，上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。但是基于目前大規(guī)模生產(chǎn)的純化方法，還不能達(dá)到100%的純度，對(duì)40mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法，其次是ULTRAPAGE；而對(duì)40mer以上的DNA制品ULTRAPAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對(duì)PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序，一定要選擇ULT

21、RAPAGE純化或HPLC純化的引物。測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物,發(fā)生的概率不大，但是偶爾也會(huì)發(fā)生。客戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列復(fù)制到合成儀的，人為造成的序列出錯(cuò)可能微乎其微。在目前的技術(shù)水平下，各家公司還沒有辦法徹底解決引物合成出錯(cuò)的這個(gè)問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所以每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有哪家公司可以完全避免。Q-3.長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？A-3:引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有

22、一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，出錯(cuò)的頻率累加起來就越高?？蛻艨傁Ｍ铣傻囊锿耆_，這種心情可以理解。但是正像PCR擴(kuò)增，不可能絕對(duì)保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。通常引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，特別是長(zhǎng)鏈引物合成，出了建議選擇ULTRAPAGE和HPLC聯(lián)合使用的純化方法，同時(shí)您也要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。Q-4.如何能保證引物的正確性?A-4:1. 訂購引物時(shí)，選用高純度級(jí)純化方法。2. 最好選用小于40個(gè)堿基的引物。3. 克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要選擇ULTRAPAGE純化或HPLC純化的引物。并且每次克隆都須進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，尤其需要注意。Q-5.PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，怎么辦?A-5:1. 遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，我們?cè)陔娔X中保留所有原始數(shù)據(jù)。2. 如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)，我們建議重新挑取克隆測(cè)序，您可能會(huì)找到正確克隆的。因?yàn)橐锛兌炔豢赡?/p>