應用多重PCR技術檢測慢性淋巴細胞白血病IgVH基因突變

1、應用多重PCR技術檢測慢性淋巴細胞白血病IgVH基因突變                 作者：鄭文娟陳麗娟吳雨潔李麗 徐衛(wèi) 李建勇 【摘要】  免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因突變是慢性淋巴細胞白血病(CLL)最重要的獨立預后因素之一，為探討CLL患者IgVH基因突變狀態(tài)，應用多重PCR技術檢測9例CLL患者的IgVH基因，純化PCR擴增產(chǎn)物后直接測序，應用IMGT/V-QUEST工具分析，明確有無IgVH突變及突變位置。結果表明

2、： 9例CLL患者皆擴增出395-465 bp區(qū)域(MIX I)或290-360 bp區(qū)域(MIX II)單克隆條帶，測序結果顯示5例患者有突變，IgVH基因分別為IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例無突變，IgVH基因為IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、 IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。結論： PCR檢測IgVH基因突變，簡化了繁瑣的實驗過程，縮短了實驗時間，解決傳統(tǒng)PCR對IgVH基因突變檢測的桎梏，值得在臨床和科研中推廣使用。 【關鍵詞】  多重PCR； IgVH；

3、 基因突變Detection of IgVH Mutation Status in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia by Multiplex PCRAbstract   IgVH mutation status is one of the most important independent prognostic factor of chronic lymphocytic leukemia (CLL).  In order to evaluate IgVH mutation status in patients

4、 with CLL, IgVH mutation was detected by multiplex PCR in 9 CLL patients and purified PCR amplification products were directly sequenced, IgH somatic hypermutation and mutation site were analysed by IMGT/V-QUEST. The results showed that 5 patients had mutated IgVH, and IgVHs were IGHV3-11*03, IGHV3-

5、9*01, IGHV3-23*01, IGHV4-59*01, IGHV4-34*02, respectively; whereas 4 others had unmutated IgVH, these IgVHs were IGHV3-53*01, IGHV3-23*03, IGHV3-33*05 and IGHV3-7*01. It is concluded that multiplex PCR is a rapid and easy method to detect IgVH mutation status, and it solves the limitations and pitfa

6、lls of routine PCR, and it is worth being extensively used both in clinic and scientific researches.Key wordsMultiplex PCR; IgVH; gene mutation慢性淋巴細胞白血病(CLL)是西方國家最常見的一種惡性淋巴細胞增殖性疾病，約占全部成人白血病的30%，主要發(fā)生在老年人，男女比例為1.3-2.01。我國發(fā)病率雖然低于西方國家，但隨著人口的老齡化，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。CLL患者的臨床病程和轉歸呈高度異質性，部分患者生存同年齡、性別匹配的正常人相同，而部分患者即

7、使接受了早期的積極治療仍很快死亡1,2。因此，CLL預后因素的檢測就顯得尤為重要。近來多個研究組3-6證實，免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因突變是最重要的獨立預后因素之一。本研究旨在應用多重RT-PCR技術研究CLL患者IgVH基因突變。材料和方法研究對象隨機選取我院血液科住院或門診的CLL患者，共9例，其中男7例，女2例，中位年齡55 (36-77) 歲。臨床分期應用Binet分期，Binet A期2例、Binet B期5例、Binet C期2例。所有患者進行外周血常規(guī)、骨髓細胞形態(tài)學和多參數(shù)流式細胞術細胞免疫分型檢測，診斷與分期均根據(jù)血液病診斷與療效標準7確定。實驗室檢查:外周血WBC

8、數(shù)10×109/L，淋巴細胞比例50%，絕對值5×109/L，骨髓增生活躍或明顯活躍，淋巴細胞數(shù)40%，以成熟淋巴細胞為主；免疫表型： CD10-、CD19+、CD5+、CD23+、CD20+和FMC7-，并排除其他疾病。收集患者的外周血或骨髓標本，用淋巴細胞分離液收集單個核細胞。IgVH基因的多重PCR檢測RNA抽提及逆轉錄采取TRIZOL一步法抽提RNA，并予以逆轉錄。逆轉錄反應體系： RNA 2  g，oligo dT 1   l (0.5   g/ l) ，5×Buffer 8   l，

9、 dNTP (40 mmol/L) 2   l，AMV 10 U(1   l)，RNasin 40 U (1   l)，DTT (100 mmol/L) 1   l，加DEPC水至40   l，70 , 10分鐘；冰上至少10分鐘；42，1小時；95，5分鐘；冰浴5分鐘，-80保存。PCR引物IgVH片段由3個框架區(qū)(framework, FR)和兩個抗原互補決定區(qū)(complementarity-determining regions, CDR)組成(圖1)。IgVH基因引物由InVivoSc

10、ribe公司提供(InVivoScribe, USA)，定購該公司編號為5-1010010的IGH Somatic Hypermutation Assay for Gel Detection試劑盒，其中有兩種混合引物：MIX I和MIX II，前者擴增領頭區(qū)(leader)和JH之間的基因，后者擴增FR1與JH間的基因。以GAPDH為內參照，上游引物： 3-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5，下游引物： 3-GAAGATGGTGATGGGATTTC-5，擴增片斷為230 bp。PCR反應體系MIX I或MIX II 45  l，Taq DNA聚合酶 1 U (0.25 l)，

11、cDNA模板5 l，共50 l反應體系。反應條件是： 94 7分鐘后， 94 45秒；60 45秒；72 90秒擴增35個循環(huán)后，72 10分鐘。以相同條件擴增試劑盒中提供的陽性和陰性參照。2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察到7例慢淋患者擴增出395-465 bp區(qū)域(MIX I)單克隆條帶，2例標本擴增出290-360 bp區(qū)域(MIX II)單克隆條帶。PCR產(chǎn)物序列分析未純化PCR原液由上海生工純化后直接測序。測序結果應用IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫分析(http:/imgt.cines.fr)，明確有無IgVH突變及突變位置。IgVH堿基突變率=錯配堿基數(shù)÷可變區(qū)總堿基數(shù)，

12、IgVH堿基突變率2%定為體細胞突變標準4,5。結果9份標本皆先用MIX I進行擴增，其中7個擴增出395-465 bp區(qū)域的單克隆條帶(標本號為1、2、4、5、7、8、9)，3號和6號標本未擴增出特異性條帶，再用MIX II擴增，擴增體系和反應條件同MIXI，結果擴增出290-360 bp區(qū)域的單克隆條帶(圖2)。測序結果應用IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫分析(圖3)。5例患者有體細胞突變，3例處于Binet B期，2例處于Binet C期，IgVH基因分別為IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例無突變，2例

13、Binet A期，2例Binet B期，IgVH基因分別為IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。IgVH突變分析見表1。Table . IgVH mutation status analysis of 9 CLL patients（略）         討論CLL是淋巴細胞克隆性增殖為特征的高度異質性惡性血液系統(tǒng)疾病。其預后的異質性使得CLL預后因素的檢測就顯得尤為重要，其中有無IgVH基因體細胞突變已被證實是目前為止與預后相關最為密切的因素。CLL根據(jù)有無I

14、gVH基因體細胞突變分成兩種類型。無IgVH基因突變型：起源于生發(fā)中心前B細胞，為生發(fā)中心前期腫瘤，病情進展快、生存期短，臨床分期多為晚期；IgVH基因突變型：起源于記憶B細胞，為生發(fā)中心后期腫瘤，病程進展緩慢，生存期很長，臨床分期多在早期3,6。本組9例患者，4例無IgVH基因突變患者2例處于Binet A期，2例處于Binet B期；5例IgVH基因突變型患者3例處于Binet B期、2例Binet 處于C期。但9例患者至今皆只隨訪2年左右，病情尚無變化。由于隨訪時間短，病例數(shù)少，IgVH突變情況無法與分期形成有效統(tǒng)計，這有待于我們在今后的研究中進一步增加病例數(shù)，延長隨訪時間，觀察疾病進展

15、情況以作出準確判斷。正常和惡性B細胞中最常見的VH家族是VH3(30%-50%)和VH4(20%-30%)，其次是VH1(10%-20%)家族，占總數(shù)的75%-95%；在Precursor B-ALL中VH6也多見8。本研究中9例標本的IgVH基因有7例屬于VH3，2例屬于VH4，與報道相符。但Tobin等9報道，IgVH基因突變型患者以VH3-21多見，無IgVH基因突變型患者以VH1-69多見。但本組9例標本均未見以上兩種IgVH基因類型。每一個B細胞都有自己長度和序列特異的由可變區(qū)(V)、多變區(qū)(D)和結合區(qū)(J)片段重排形成的位于14q32、大約1250 bp IgH基因。IgH基因包

16、括7個VH家族(現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)52個有功能的VH片段，30個無功能的VH片段)、7個DH家族(現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)27個有功能的DH片段)、6個JH家族(現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)6個有功能的JH片段)。不同V、D、J區(qū)的排列組合大約有2×106，而基因重組過程中的核苷酸的隨機缺失和插入，使得排列組合的數(shù)目劇增，超過至1012。淋巴細胞的Ig分子要經(jīng)過生發(fā)中心的體細胞高度突變才能成為成熟的B細胞(因此生發(fā)中心或生發(fā)中心后期起源的成熟的B細胞惡性腫瘤中存在有體細胞突變)，而這一過程同時擴大了Ig排列組合的數(shù)目8,10。IgVH基因片段中FR序列相對保守，而CDR即使在同一VH家族中也高度不同，是生發(fā)中心期體細胞突變的高發(fā)

17、區(qū)，盡管FR不易發(fā)生體細胞突變，但可發(fā)生核苷酸置換，尤其易發(fā)生在高度突變的B細胞?，F(xiàn)在在一些實驗室開展的PCR技術檢測IgVH基因是應用單個VH通用引物，與三個FR中的一個通常是FR3的序列互補，這種通用引物不能以相同效率擴增所有VH片段；而且由于體細胞突變并不是局限于CDR，也會發(fā)生在FR，如果FRs區(qū)域發(fā)生了基因突變，就會阻礙通用引物和FR的目的序列結合，導致克隆PCR產(chǎn)物檢測失敗。由于IgH基因的多態(tài)性，CLL IgVH突變狀態(tài)應用常規(guī)PCR方法檢測所需引物眾多，技術繁雜，標本需求量大，耗時久，費用高，在普通的實驗室難以開展，且容易產(chǎn)生假陰性或假陽性結果。因此雖然早在10多年前就提出Ig

18、VH體細胞突變與CLL預后有密切關系，但大部分實驗室無常規(guī)開展此工作的條件。本研究小組曾在1年前應用上述方法檢測IgVH突變狀態(tài)，在近30份標本中僅1份擴增出特異性片段，每份標本需進行36次PCR過程，由于其耗時低效而終止研究。而本次研究采用多重PCR檢測IgVH基因突變，簡化了繁瑣的實驗過程，縮短了實驗時間，而且由于InVivoScribe 公司提供的試劑盒中提供陽性和陰性參照，減少了假陰性假陽性結果出現(xiàn)的幾率，使實驗結果更加可信。多重PCR解決了傳統(tǒng)PCR對IgVH基因突變檢測的桎梏,值得在臨床和在科研中推廣?，F(xiàn)在國內外大量實驗證實，IgVH基因突變與ZAP-70、CD38、細胞遺傳學異常

19、、sCD23、胸苷激酶、LPL等一系列CLL預后指標都有一定的相關性6,11。我們將進一步進行IgVH基因突變與上述CLL指標的預后關系，以便共同評價預后，指導治療?！緟⒖嘉墨I】  1 Shanafelt TD, Geyer SM, Kay NE. Prognosis at diagnosis: integrating molecular biologic insights into clinical practice for patients with CLL. Blood, 2004;103:1202-12102 Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M.

20、 Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med,2005;352: 804-8153 陳麗娟（綜述）,李建勇（審校）. 慢性淋巴細胞白血病IgV(H)基因突變研究進展. 國外醫(yī)學·輸血及血液學分冊, 2003;26:155-1564 Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood,1999;94:1848

21、-18545 Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood,1999;94:1840-18476 Montillo M, Hamblin T, Hallek M, et al. Chronic lymphocytic leukemia: novel prognostic factors and their relevance for risk-adapted therapeutic strategies. Haematologica,2005;90: 391-3997 張之南,沈悌. 血液病診斷及療效標準. 第二版, 科學出版社. 北京: 1998: 228-2368 van Dongen JJM, Langerak AW, Bruggemann M, et al. Design and standardization of PCR primers and