當歸阿魏酸鈉局部用藥治療骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究

1、當歸阿魏酸鈉局部用藥治療骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究 10-05-05 15:36:00 編輯：studa20 作者：劉保新，陳廖斌，汪 暉，秦俊，商亮 【摘要】 目的探討當歸、阿魏酸鈉關(guān)節(jié)腔注射對大鼠骨關(guān)節(jié)炎(OA)的療效。方法40只大鼠木瓜蛋白酶法建立雙膝OA模型，造模后分為模型對照組，25%及5%當歸治療組，0.5%及0.1%阿魏酸鈉治療組，另取8只大鼠作正常對照；各組關(guān)節(jié)腔注射相應(yīng)濃度藥物或生理鹽水0.1 ml，3日一次；6周后檢測血漿、關(guān)節(jié)液SOD、MDA，關(guān)節(jié)軟骨取材光鏡觀察，檢測軟骨MMP-1、TIMP-1、Bcl-2、Bax的表達。結(jié)果25%當歸和0.5%阿魏酸鈉可增加血漿、關(guān)節(jié)液SOD

2、活性(均P0.05)并降低其MDA水平(均P0.01)；降低關(guān)節(jié)軟骨Mankins評分(均P0.01），降低軟骨細胞MMP-1、Bax的表達(P0.05或P0.01)，同時使TIMP-1、Bcl-2的表達增加(P0.05或P0.01)；5%當歸無顯著效果，0.1%阿魏酸鈉對部分檢測指標有統(tǒng)計意義。結(jié)論當歸、阿魏酸鈉關(guān)節(jié)腔注射治療大鼠OA均有療效，其作用具有劑量依賴性，阿魏酸是當歸注射液治療OA的有效單體成分。 【關(guān)鍵詞】 骨性關(guān)節(jié)炎； 當歸； 阿魏酸鈉； 金屬蛋白酶類； 細胞凋亡 Abstract: ObjectiveTo explore the therapeutic effects of

3、angelica and sodium ferulate (SF) on experimental osteoarthritis and the related mechanisms in rats. MethodAnimal models of osteoarthritis were established in 40 rats by intra-articular injection of 4% papain. The rats were divided into five groups - model control group,25% and 5% angelica treatment

4、 groups, 0.5% and 0.1% SF treatment groups.Another additional 8 rats were used as normal control. Bilateral knees of the animalsin the treatment groups began receiving intra-articular injection of 0.1ml angelica injection or SF of corresponding concentration respectively every 3 days while those of

5、the animals in the control groups received saline. All the animals were sacrificed 6 weeks later and samples of the cartilage, plasma and synovial fluid were taken. The contents of MDA and the activities of SOD in the plasma and synovial fluid were detected.Histological examinations of the cartilage

6、 were performed and immunohistochemical analyses for MMP-1, TIMP-1, Bcl-2 and Bax in the cartilage were done.Result25% Angelica and 0.5% SF significantly decreased the levels of MDA in both plasma and synovial fluid (P0.01, P0.01) while they increased their SOD activities (P0.05, P0.05). In the mean

7、time, Mankins scores of cartilage were reduced (P0.01, P0.01), and the gray scores of MMP-1 and Bax in the cartilage were reduced too(P0.05, P0.01) while those of TMP-1 and Bcl-2 were increased (P0.05, P0.01). 5% angelica had no significant effect on all the parameters while 0.1% SF took significant

8、 effects on most of the parameters.ConclusionInjected intra-articularly, both angelica and sodium ferulate have beneficial effects on osteoarthritis in rats. Ferulate is one of effective components of angelica in treating osteoarthritis. Key words：osteoarthritis; angelica; sodium ferulate; metallopr

9、oteinases; apoptosis 骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理特征的慢性進行性骨關(guān)節(jié)病。因其病程較長，病情反復(fù)發(fā)作，嚴重影響了中老年人的生活質(zhì)量， 目前尚缺乏對疾病本身有特效的治療藥物。當歸(angelica，AG)是明清以來治療OA的中醫(yī)方藥中應(yīng)用頻率最多的中藥1。當歸注射液是當歸的水溶液，阿魏酸是當歸注射液的單體成分，藥理作用與當歸注射液相近。本實驗將不同濃度的當歸、阿魏酸鈉(sodium femlate，SF)關(guān)節(jié)腔注射治療大鼠實驗性O(shè)A，以觀察其療效并研究相關(guān)機制，同時探討阿魏酸是否為當歸注射液治療OA有效的單體成

10、分。 1 材料與方法 1.1 藥物、試劑與儀器：25%當歸注射液(武漢大學中南醫(yī)院制藥廠)，阿魏酸鈉粉針(重慶藥廠)；木瓜蛋白酶(Merck公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metallo proteinase-1，MMP-1）及金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)抗體，Bcl-2蛋白、Bax蛋白抗體，SABC、DBA試劑盒(武漢博士德)。765紫外分光光度計(shimadzu UV120-02)，HPIAS-1 000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(同濟千屏)。 1.2 動物與造模：健康Wistar大鼠48

11、只，雌雄各半，體重200220 g。正常飼養(yǎng)1周后，隨機抽取40只，參照文獻方法2，雙膝關(guān)節(jié)分別注射4%木瓜蛋白酶0.1 ml，1次/3 d，共注射3次。剩余8只同法注射等量生理鹽水。 1.3 分組：造模末次注射1周后分組，未造模的8只作為正常對照組。造模的40只隨機分為5組：模型對照組、25%AG治療組、5%AG治療組、0.5%SF治療組、0.1%SF治療組，每組8只，雌雄各半。各治療組雙膝關(guān)節(jié)分別注射25%、5%AG，0.5%、0.1%SF各0.1 ml，3 d一次，正常組和模型對照組按同法注射生理鹽水0.1 ml作對照，6周后取材。 1.4 取材與檢測：采用心臟取血3 ml，肝素抗凝3

12、000 r/min離心取血漿。取血后氣栓法處死，雙膝關(guān)節(jié)分別用0.15 ml雙蒸水反復(fù)抽吸沖洗，30 s后雙膝共抽取關(guān)節(jié)洗液0.16 ml左右。鄰苯三酚法測定血漿、關(guān)節(jié)液超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)活性，TBA分光光度法測定血漿、關(guān)節(jié)液丙二醛(maldialdehyde，MDA)含量。切開雙膝關(guān)節(jié)，肉眼及手術(shù)顯微鏡觀察軟骨表面。切下右側(cè)脛骨上端，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片(免疫組化切片行多聚賴安酸處理)，HE及甲苯胺藍染色，光鏡觀察軟骨的改變。MMP-1、TIMP-1、Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表達采用免疫組化方法進行檢測，方法步驟按照各試劑盒說明進行

13、。圖像分析處理：在40倍顯微鏡下隨機選取8個不重疊的視野，測定陽性細胞的灰度值，取每張切片均值作為其測量值。 1.5 統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)以(x-s)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計包進行處理，以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 2 結(jié)果 2.1 肉眼及手術(shù)顯微鏡下觀察 各組關(guān)節(jié)軟骨按Mankins關(guān)節(jié)軟骨大體評分標準3評分無顯著差別。關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，模型及5%AG治療組關(guān)節(jié)軟骨表面呈淡黃色，其他各組呈淡藍色。 2.2 HE、甲苯胺蘭染色光鏡觀察及評分 模型與5%AG組切片光鏡觀察：軟骨表面有小裂紋與潰瘍，細胞明顯增生，大小不一，四層結(jié)構(gòu)紊亂，潮線不清晰或多重，甲苯胺蘭染色重度降低；25%AG

14、、0.5%SF、0.1%SF組軟骨表面光滑、完整，細胞排列稍有紊亂，四層結(jié)構(gòu)清晰，潮線清晰完整，甲苯胺蘭染色前兩組著色正常或輕度降低，0.1%SF組中度降低。按Mankins標準評分并進行統(tǒng)計(表1)，結(jié)果顯示：與模型組比較，除5%AG組外，其余各治療組均降低了Mankins評分(均P0.05)。 表1 各組軟骨組織Mankins評分 注：與模型組比較，#P0.012.3 當歸、阿魏酸鈉對血漿、關(guān)節(jié)液SOD、MDA的影響 模型對照組血漿、關(guān)節(jié)液SOD有明顯的降低(均P0.01)，MDA明顯升高(均P0.01)，符合OA的生化改變。25%AG與0.5%SF能顯著提高血漿與關(guān)節(jié)液中的SOD活性(均

15、P0.05)，降低MDA的水平(均P0.01)；5%AG與0.I%SF對血漿與關(guān)節(jié)液SOD無明顯作用，但5%AG可顯著降低關(guān)節(jié)液MDA的水平(P0.05)，0.1%SF可顯著降低血漿與關(guān)節(jié)液的MDA水平(P0.01或P0.05)。具體結(jié)果見表2。表2 各組動物血漿、關(guān)節(jié)液SOD(KU/L，x-s)及MDA(，x-s)組別n血 漿關(guān)節(jié)液SODMDASODMDA正常組882.7312.07#0.730.08#904.42126.76#0.710.14# 模型組852.5116.571.190.15589.52144.971.090.8825%AG組870.9912.81#0.92

16、0.13#795.96207.71#0.880.19#5%AG組863.0922.351.110.10655.34136.021.000.08#0.5%SF組880.8928.53#0.770.10#805.13153.93#0.850.09#0.1%SF組867.9611.880.990.08#685.5599.240.960.08# 注：與模型組比較，#P0.05，#P0.012.4 免疫組化及圖像分析 10-05-05 15:36:00 編輯：studa20 切片用DBA染色的陽性結(jié)果為軟骨細胞胞漿呈棕褐色或棕黃色顆粒，陰性胞漿不著色或僅有背景著色，各組切片圖像分析結(jié)果見表3。相對于模型

17、組，25%AG和0.5%SF治療組軟骨細胞MMP-1、Bax蛋白表達的灰度值顯著降低(P0.05或P0.01)，TIMP-1、Bcl-2蛋白表達的灰度值顯著增加(P0.05或P0.01)；5%AG、0.1%SF治療組軟骨細胞MMP-1、TIMP-1的灰度值無明顯影響，但0.1%SF治療組軟骨細胞Bax蛋白表達的灰度值顯著降低(P0.05)，Bcl-2蛋白的灰度值顯著增加(P0.05)。表3 MMP-1、TIMP-1、Bcl-2、Bax在各組軟骨表達的灰度值x-s)組別nHMP-lTIMP-1Bax蛋白Bcl-2蛋白正常組8217.4521.04#213.4920.97#215.1415.43#

18、210.6417.73#模型組8152.5622.64180.4732.60149.3112.77189.2134.2125%AG組8172.4619.72#159.4624.76#170.6914.14#158.2122.61#5%AG組8157.7419.72175.9631.94158.0426.70177.2118.950.5%SF組8186.0431.18#157.1123.54#186.0631.16#148.3616.21#0.1%SF組8170.3127.12168.4426.77165.6822.98#166.3123.86 注：與模型組比較，#P0.05，#P0.013 討

19、論 中藥是中國醫(yī)藥學的瑰寶，在當今世界“回歸自然”理念的影響下，中藥正以其豐富的自然資源、獨特的療效、毒副作用少等特點，越來越引起世人的關(guān)注。WTO的加入為中藥帶來了前所未有的發(fā)展機遇，而知識產(chǎn)權(quán)的保護又為我國新藥研制帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。針對某種疾病篩選出理想的中藥，分析其活性成分并進行結(jié)構(gòu)改造可成為創(chuàng)新藥物的途徑之一。本實驗針對OA，參照傳統(tǒng)治療，篩選出中藥當歸，觀察了不同濃度的AG及其單體成分(SF)關(guān)節(jié)腔注射治療OA的療效。結(jié)果，除5%AG外，25%AG與0.5%SF、0.1%SF均有明顯的效果，促進了退變軟骨的修復(fù)。這說明，一定濃度的AG與SF關(guān)節(jié)腔注射治療OA均具有明顯的效果，阿魏

20、酸是AG治療OA有效的單體成分。 對于OA的發(fā)病機制，目前尚未完全研究清楚。但從病理角度看，軟骨細胞賴以生存的細胞外基質(zhì)異常降解是導(dǎo)致軟骨退變的重要原因之一，許多體內(nèi)外的研究已證明，自由基、細胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶類等因素在這一降解過程中起重要作用。本實驗主要觀察兩種藥物對這三種因素的影響以探討藥物作用的相關(guān)機制。OA的發(fā)病機制中研究較早的是關(guān)節(jié)局部的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，引起軟骨的退變，表現(xiàn)為SOD的活性消耗性下降，MDA含量增高。反之，氧自由基代謝紊亂的恢復(fù)也可促進關(guān)節(jié)軟骨退變的恢復(fù)4、5。隨著對OA的研究深入，發(fā)現(xiàn)OA的發(fā)生與軟骨細胞過度凋亡密切相關(guān)，并受相關(guān)

21、基因調(diào)控。Bax蛋白為促凋亡基因蛋白，Bcl-2蛋白家族為目前發(fā)現(xiàn)的最重要的抗凋亡基因蛋白。Bcl-2蛋白抗凋亡作用與其跨膜蛋白抑制Ca+超載，阻止凋亡基因信號傳遞或基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)及抑制自由基的產(chǎn)生有關(guān)。同時，研究也表明Bcl-2蛋白對細胞凋亡的影響與Bcl-2蛋白及Bax蛋白之間的比率大小有關(guān)，當Bcl-2蛋白高表達時，可形成Bcl-2-Bax異源二聚體，抑制細胞凋亡6。近年來，金屬蛋白酶類(MMPs)逐漸成為OA發(fā)病的研究熱點，MMPs是一組能降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶家族，可造成關(guān)節(jié)軟骨腫脹，抗外力作用下降，最終導(dǎo)致對關(guān)節(jié)軟骨造成進行性破壞。目前的研究發(fā)現(xiàn)，OA的發(fā)病主要與MMP-1、3、7

22、、9、13相關(guān)，而破壞II型膠原最主要的蛋白酶是MMP-1。金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)能與相應(yīng)的MMPs特異性結(jié)合，抑制其生物活性的發(fā)揮，抑制MMPs的破壞作用，從而促進退變軟骨的修復(fù)7。 本實驗中，一定濃度的AG與SF均能較好地升高血漿與關(guān)節(jié)液的SOD活性，降低MDA的水平；抑制MMP-1與Bax的表達而增強TIMP-1與Bcl-2蛋白的表達，促進了Bcl-2Bax比率失調(diào)的恢復(fù)，從而對OA起到了較好的治療效果。同時，實驗也觀察到，當兩種藥物濃度較低時，對自由基、基質(zhì)金屬蛋白酶類、細胞凋亡的多數(shù)指標影響較小。這說明，這兩種藥物對3種因素的影響具有一定的劑量依賴性。 當歸注射液是一種含多種

23、成分的醇提取水溶液，阿魏酸是當歸注射液中重要的單體成分之一。據(jù)文獻8報道，25%當歸注射液0.1 ml含阿魏酸5.1410-7 g，而本實驗所用0.5%阿魏酸鈉注射液0.1 ml含阿魏酸510-4 g，兩者在阿魏酸含量上相差3個數(shù)量級，而療效無明顯差別，可見當歸注射液中還含有其它的有效治療成分。但阿魏酸作為一個有效的單體藥物，普遍存在于多種中草藥中，又能通過簡單原料經(jīng)化學工藝進行合成，便于規(guī)模生產(chǎn)，在臨床應(yīng)用中應(yīng)該會有較好的前景?！緟⒖嘉墨I】 1 鄭紅.明清醫(yī)家論治骨痹(骨關(guān)節(jié)炎)用藥規(guī)律研究J.山東中醫(yī)藥大學學報，2003，27：95-97.2 Lin YS, Huang MH, Chai CY. Effects of heliumneon laser on the mucopolysaccharide induction in experimental osteoarthritic cartilageJ.Osteoarthritis Cartilage，2006,14:377-383.3 Hayami T, Pickarski M, Zhuo Y, et al