套式聚合酶鏈反應(yīng)快速診斷結(jié)核性心包炎

1、套式聚合酶鏈反應(yīng)快速診斷結(jié)核性心包炎摘要快速診斷結(jié)核性心包炎以便及早抗癆治療防止縮窄性心包炎的發(fā)生。應(yīng)用套式聚合酶鏈反應(yīng)(Nested-PCR)、直接涂片、培養(yǎng)對(duì)83例心包積液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核菌檢測(cè)。結(jié)果：結(jié)核性心包積液Nested-PCR陽性率為72.5%、培養(yǎng)陽性率為19.6%、涂片鏡檢陽性率為23.5%。非結(jié)核性心包積液無1例陽性。Nested-PCR特異性好、敏感性強(qiáng)并可能避免一般聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)所出現(xiàn)的假陽性。關(guān)鍵詞套式聚合酶鏈反應(yīng)心包積液結(jié)核桿菌 The Rapid Diagnosis of Tuberculous PericarditisUsing Nested Poly me

2、rase Chain ReactionMa Lu,Liu Chuanjun,Jiang Xiaoqin,et alThe 460th Hospital of the PLAZhengzhou(450007)AbstractObjective:to evaluate a rapid diagnostic method for tuberculous pericarditis.Met hods:nested polymerase chain reaction(nested-PCR) was used to detect the DNA of mycobacterium tuberculosis i

3、n 83 patients with hydropericardium.The results were compared with two traditional methods,acid-fast staining and culture.Results:a mong 51 tuberculous pericarditis patients,the diagnostic positive rates was 72.5 % by nested-PCR,but only 23.5% and 19.6% by acid-fast staining and culture.The sensitiv

4、ity of nested-PCR for diagnosis of tuberculous pericarditis was much higher than other two methods.(P0.01) All of 32 non-tuberculous hydroperi card itis had the negative results from nested-PCR.Conclusion:the nested-PCR is a t ime-saving method for rapid diagnosis of tuberculous pericarditis with mu

5、ch hig her sensitivity and specificity compared with that from traditional methods.Key words: Nested polymerase chain reaction;Hydropericardium;Mycobacterium tuberculosis.對(duì)結(jié)核性心包炎的診斷，一般常根據(jù)臨床表現(xiàn)、心包積液的一般性狀、化學(xué)檢查、顯微鏡檢查、涂片染色以及細(xì)菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法。這些方法敏感性低、特異性差、操作繁瑣費(fèi)時(shí)，常延誤治療時(shí)機(jī)，一般聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)又易出現(xiàn)假陽性1。我們用Nested-PCR檢測(cè)結(jié)核菌，初

6、步探討了Nested-PCR診斷結(jié)核性心包炎的臨床應(yīng)用價(jià)值。材料與方法一、材料1.標(biāo)本的收集結(jié)核性心包炎51例，根據(jù)臨床表現(xiàn)、X線檢查合并有肺結(jié)核及/或縱隔淋巴結(jié)結(jié)核、心包積液涂片抗酸染色及培養(yǎng)證實(shí)且抗癆治療有效。癌性心包積液27例經(jīng)組織學(xué)證實(shí)鱗癌4例、腺癌7例、小細(xì)胞癌13例、惡性心包間皮癌3例。急性化膿性心包炎1例。急性非特異性心包炎3例。心肌梗塞后Dressler綜合征1例。嚴(yán)格消毒心包穿刺，抽取心包積液同時(shí)行涂片鏡檢、培養(yǎng)及Nested-PCR檢測(cè)。2.主要試劑和儀器引物根據(jù)吳勤學(xué)等2報(bào)道的序列合成：外引物：GTG GCC CAG ATC CGC CAGCAT GTC GCC ACC

7、GGG AA內(nèi)引物：TTG CAA GCG GCC CCG ACC CCCA CCG GGA ACG GAA GCC TT外引物對(duì)將放大結(jié)核菌groEL基因的576bp片段，其中含有內(nèi)引物對(duì)的部位，內(nèi)引物對(duì)將放大出344bp的DNA片斷。TagDNA聚合酶和脫氧核糖核苷酸(dNTP)均購自Promega公司。DNA標(biāo)準(zhǔn)Maker為：174RFDNA/HaeFragment和pGEM-72(+)Hae及其他試劑均購自華美生物工程公司。PCR擴(kuò)增儀購自華美生物工程公司，型號(hào)：ZW-增強(qiáng)型。二、方法1.心包積液涂片及培養(yǎng)心包積液離心取沉淀按常規(guī)方法涂片作萋尼氏抗酸染色鏡檢，結(jié)核菌培養(yǎng)及菌型鑒定按照中

8、國防癆協(xié)會(huì)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查方法規(guī)程進(jìn)行。2.Nested-PCR檢測(cè)：心包積液結(jié)核菌基因組DNA提取參照Wit等3報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。先用外引物對(duì)將DNA模版放大25個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體積25ul:外引物對(duì)2.0ul，DNA模版2.0ul，DNA聚合酶0.5U,4dNTP終濃度為0.1mmol/L，10buffer2.5ul，用蒸鎦水補(bǔ)足25ul。(第一次放大條件為：94變性3min后，9470秒，552min，722min，循環(huán)25次。最后72延伸8min)，而后用內(nèi)引物對(duì)再放大25個(gè)循環(huán)(第二次放大條件及反應(yīng)體積同第一次放大)。取第二次放大產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖膠(內(nèi)含嗅乙啶0.5ug/ml)上

9、進(jìn)行電泳，每槽加樣20ul，上樣緩沖液5ul，恒流電泳(50mA)待溴酚藍(lán)帶泳至膠面4cm處關(guān)閉電泳儀，電泳后紫外檢測(cè)并照像。擴(kuò)增成功時(shí)紫外檢測(cè)可見344bp桔紅色條帶。結(jié)果Nested-PCR與培養(yǎng)、涂片鏡檢比較均有顯著性差異(x2檢驗(yàn)：P均0.01)，所有非結(jié)核性標(biāo)本檢測(cè)均為陽性。表183例心包積液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果心包積液性質(zhì)例數(shù)涂片鏡檢培養(yǎng)Nested-PCR(+)(-)(+)(-)(+)(-)結(jié)核性51123910413714非結(jié)核性32032032032表23種方法檢測(cè)結(jié)核菌陽性率的比較方法Nested-PCR培養(yǎng)涂片鏡檢陽性率(%)72.519.623.5討論心包疾病約占心血管病住院患

10、者的1.5%6%，在我國結(jié)核仍為心包炎的常見病因4，結(jié)核性心包積液常發(fā)展為縮窄性心包炎5，6。早期診斷和抗癆治療對(duì)于防止其轉(zhuǎn)變?yōu)榭s窄性心包炎甚為重要6。傳統(tǒng)的診斷方法敏感性低、特異性差、操作繁瑣費(fèi)時(shí)，常延誤治療時(shí)機(jī)。眾多報(bào)道PCR檢測(cè)各種臨床標(biāo)本中結(jié)核菌具有快速、敏感之優(yōu)點(diǎn)，但容易出現(xiàn)假陽性，即污染7和特異性的問題，有報(bào)道假陽性高達(dá)14.3%8。有作者發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核PCR假陽性大部分為肺部惡性腫瘤所致9。而Nested-PCR用內(nèi)引物和第二次放大循環(huán)次數(shù)少，減少背景帶而提高了特異性；且最后產(chǎn)物以內(nèi)引物特異性為基礎(chǔ)放大，與外引物不同，從而克服了污染10。我們用Nested-PCR檢測(cè)83份心包積液標(biāo)

11、本，51例結(jié)核性心包積液的陽性檢出率為12.5%，經(jīng)x2檢驗(yàn)明顯優(yōu)于培養(yǎng)和涂片鏡檢(P均0.01)，而且Nested-PCR檢測(cè)只需1天，結(jié)核培養(yǎng)時(shí)間則需849天。涂片鏡檢與Nested-PCR所需時(shí)間相同，但涂片陽性率低，而且鏡檢所依據(jù)的結(jié)核菌抗酸染色性實(shí)質(zhì)上是分支桿菌屬的特異性，不能作為結(jié)核菌種鑒定的細(xì)菌學(xué)依據(jù)。同時(shí)，臨床標(biāo)本中經(jīng)常存在的異型形態(tài)，有時(shí)會(huì)造成結(jié)果判定的困難11。在本次Nested-PCR實(shí)驗(yàn)中，32例非結(jié)核性心包積液包括27例癌性心包積液標(biāo)本無1例陽性。只要嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，有可能避免一般PCR所出現(xiàn)的假陽性。 苗靈娟（河南省中醫(yī)藥研究院）；王顯（河南省胸科醫(yī)院）作者單位：鄭州

12、解放軍460醫(yī)院(450007)內(nèi)四科參考文獻(xiàn)1潘毓萱.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用及存在問題.中華結(jié)核和呼吸雜志，1995，18：197.2吳勤學(xué)，李新宇，魏萬惠，等.套式結(jié)核菌基因擴(kuò)增試驗(yàn)的建立及初步應(yīng)用.中華結(jié)核和呼吸雜志，1994，17：295.3Wit D,Marrtens G,Steyn L,et al.A comparative study of the polymerase c hain reaction and conventional procedures for the diagnosis of tuberculous pleur al effusion.Tu

13、ber Lung Dis,1992,73:262.4陳灝珠主編.內(nèi)科學(xué).第四版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997，8：315.5張紹儀，杜修海.經(jīng)劍突下心包穿刺留置導(dǎo)管治療癌性或結(jié)核性心包積液的經(jīng)驗(yàn). 中華結(jié)核和呼吸雜志，1994，17：52.6陳灝珠主編.內(nèi)科學(xué).第四版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997，8：318319.7Sarker G,Sommer SS.Shedding light on PCR contamination.Nature,1990,3 43:27.8施煥中，李超乾，龍學(xué)明，等.聚合酶鏈反應(yīng)在診斷結(jié)核性胸腔積液中的應(yīng)用.中華結(jié)核和呼吸雜志，1994，17：287.9張言斌，譚耀駒，譚守勇，等.聚合酶鏈反應(yīng)用于涂陰結(jié)核早期診斷的評(píng)價(jià).中華 結(jié)核和呼吸雜志，1998，21：60.10Plika