葉酸受體介導(dǎo)卵巢癌細胞靶向白蛋白納米粒的體外研究

1、_葉酸受體介導(dǎo)卵巢癌細胞靶向白蛋白納米粒的體外研究*張良珂1侯世祥1毛聲俊1魏大鵬2宋相容1喬小蓉31. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥劑教研室 （成都610041）；2. 四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫教研室；3. 四川大學(xué)分析測試中心【摘要】 目的 研究能通過葉酸受體介導(dǎo)靶向腫瘤細胞的葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒。方法 利用葉酸活性酯在堿性條件下與白蛋白納米粒表面上的氨基反應(yīng)，制得葉酸偶聯(lián)的白蛋白納米粒。以熒光定量法確定濃度、時間、游離葉酸對腫瘤細胞攝取葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的影響程度。結(jié)果 成功制備了葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒。葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的腫瘤細胞攝取量隨納米粒濃度增大、培養(yǎng)時間延長而增加，腫瘤細胞對葉

2、酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的攝取可被過量的外源性游離葉酸所抑制。結(jié)論 葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒能通過細胞膜上的葉酸受體介導(dǎo)內(nèi)吞入胞，可顯著靶向于葉酸受體豐富的腫瘤細胞。【關(guān)鍵詞】 白蛋白納米粒 葉酸受體 靶向Study on the ovarian tumor cell targetability of folate receptor-mediated albumin nanoparticles【Abstract】Objective To study folate-conjugated albumin nanoparticles targeting to tumor cells via folate re

3、ceptor-mediated endocytosis. Methods The activated folic acid (N-hydroxysuccinimide ester of folic acid) were conjuated to the surface of BSANP via the amino groups. The extent that concentration, incubated time and free folate influenced uptake of folate-BSANPs by SKOV3 cell was determined respecti

4、vely using fluorescence spectrophotometer. Results Folate-conjugated BSANP (Folate-BSANP) was successfully achieved. Uptake of folate-BSANPs by tumor cells was gradually increased while extending incubated time or increasing concentration of folate-BSANPs and could be competitively inhibited by exce

5、ss free folate. Conclusion Folate-BSANP could be delivered into tumor cells via folate receptor-mediated endocytosis and significantly targeted to tumor cells with rich folate receptors.【Key words】Albumin nanoparticles ; Folate receptor ; Targeting隨著對細胞膜表面葉酸受體認識的逐步深入研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和腎細胞

6、癌等)膜表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細胞，為葉酸受體介導(dǎo)藥物靶向于腫瘤細胞的研究奠定了基礎(chǔ)1。白蛋白分子中賴進行了研究，并選用人卵巢癌SKOV3細胞作為模型細胞，考察folate-BSANP 對腫瘤細胞的靶向效果。 1 材料和方法 1.1 材料 Startorious 1721型電子天平（德國）、UV-2201型紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）、Malvern-2000型激光散射粒徑分析儀（英國）、85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）、HITACHIH-600 透射電子顯微鏡（日本）、SHZ-88-1型臺式水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉鹿河生化儀器廠）、RF-500

7、0熒光分光光度計（日本）、Olympus熒光顯微鏡（日本）、SHEL-LABl815Tc型CO2恒溫培養(yǎng)箱。 氨酸數(shù)目眾多（約占殘基數(shù)的10%）。暴露于白蛋白納米粒表面的賴氨酸-氨基及末端氨基，即表面活性氨基（surface reactive amino groups, SRAG），系其進行化學(xué)修飾的有效連接部位。為此我們首次制備了葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒（folate conjugated bovine serum albumin nanoparticles，folate-BSANP），對其相關(guān)性質(zhì)* 高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金 (20020610092)通訊作者，Tel：86-28-855

8、02809，F(xiàn)ax：86-28-85502809，E-mail：housix 牛血清白蛋白（生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司）、Sephadex G-50（Pharmacia）、N-羥基琥珀酰亞胺（Sigma）、葉酸（Sigma）、二環(huán)己基碳二亞胺_中國科技論文在線（Acros）、胰蛋白酶（生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司）、異硫氰酸熒光素（Sigma）、SKOV3細胞（本校免疫教研室提供）、無葉酸細胞培養(yǎng)液（Gibco），其余藥品、試劑均為分析純。2 方法1.2.1 白蛋白納米粒 (BSANP) 的制備 取牛血清白蛋白（BSA）適量，精密稱重后加蒸餾水溶解，室溫攪拌下緩慢滴加適量的無水乙

9、醇。續(xù)緩加入適量戊二醛溶液，攪拌12h，減壓蒸餾除去乙醇，即得BSANP的膠體混懸液。1.2.2 葉酸活性酯的制備 500mg的葉酸溶于10ml二甲亞砜（已預(yù)先加入0.25ml的三乙胺），攪拌下加入適量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應(yīng)過夜。過濾，除去反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，減壓濃縮至干。用乙醚洗滌殘余固體，得淺黃色固體粉末，即葉酸活性酯2。1.2.3 Folate-BSANP的制備 取BSA-NP膠體混懸液適量，用NaCO3/NaHCO3緩沖溶液（pH=11.5）調(diào)pH為9，加入適量的葉酸活性酯的二甲亞砜溶液，室溫攪拌。用Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱進行分離，收

10、集先流出的有乳光部分，即Folate-BSANP膠體混懸液。1.2.4 Folate-BSANP偶聯(lián)程度的測定 測定Folate-BSANP胰蛋白酶水解液在358nm處的吸光度，在相應(yīng)的標準曲線上可得單位質(zhì)量BSA上偶聯(lián)葉酸的量，并采用2,4,6-三硝基苯磺酸顯色法3測定了BSANP的表面活性氨基的含量。1.2.5 Folate-BSANP的形態(tài)觀察 分別將所得Folate-BSANP溶液上樣G-50 Sephadex柱，蒸餾水進行洗脫，收集乳光部分。室溫條件下用2%磷鎢酸負染樣品后，HITACHI H-600 透射電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)，并拍攝照片。1.2.6 BSA-NP與Folate-B

11、SANP的粒徑大小分布測定 室溫條件下，分別取BSA-NP與Folate-BSANP膠體混懸液適量，加入至蒸餾水400ml中，用激光散射粒徑分析儀分別測定所得納米粒的粒徑及其分布。1.2.7 Folate-BSANP與BSANP的腫瘤細胞攝取實驗 采用人卵巢癌細胞(SKOV3)作為模型細胞，用異硫氰熒光素(FITC)對BSA分子進行熒光標記，以熒光定量的方法考察skvo3細胞攝取納米粒的情況。 將SKOV3細胞接種到24孔板上，每孔約3×104個細胞，孵育約24h后，換液，用PBS洗滌，換10%小牛血清/無葉酸RPMI1640配制的培養(yǎng)液對人卵巢癌細胞（SKOV3）貼壁培養(yǎng)(37，5

12、%CO2培養(yǎng)箱)24。所得樣本用于下述實驗。 1.2.7.1 納米粒濃度對腫瘤細胞攝取的影響 分別加1.0ml上述培養(yǎng)液配制的各濃度Folate-BSANP或BSANP膠體溶液于含預(yù)培養(yǎng)SKOV3細胞的孔內(nèi)，培養(yǎng)4。 1.2.7.2 培育時間對腫瘤細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響 分別取0.45mg/ml的Folate-BSANP或BSANP膠體溶液1.0ml于含預(yù)培養(yǎng)SKOV3細胞的孔內(nèi)，培養(yǎng)0、0.5、1、2、3和4。 1.2.7.3 游離葉酸對腫瘤細胞攝取的影響 分別加上述培養(yǎng)液配制的含不同濃度葉酸的0.45mg/ml Folate-BSANP或BSANP膠體溶液1.0

13、ml于含預(yù)培養(yǎng)SKOV3細胞的孔內(nèi)，培養(yǎng)4。 上述方法培養(yǎng)后的SKOV3細胞均用冷磷酸緩沖液洗滌(1.0ml×6)，1%TritonX 100PBS緩沖液(0.75ml)破細胞，用熒光分光光度計測定細胞溶解液熒光（ex=490nm，em=520nm）。 1.2.7.4 Folate-BSANP與BSANP腫瘤細胞攝取的定性觀察 將SKOV3細胞貼壁預(yù)培養(yǎng)于玻片上,分別加入相同濃度的Folate-BSANP和BSANP培養(yǎng)3，磷酸緩沖液洗滌，SKOV3細胞固定，熒光顯微鏡觀察并攝片記錄。 2 結(jié)果 2.1 Folate-BSANP與BSANP的形態(tài)、粒徑大小及分布 透射電鏡觀察，納米粒

14、形態(tài)圓整，大小較均勻，見圖1。激光散射法測定的BSANP平均粒徑為64nm，90%的粒徑小于119nm。Folate-BSANP平均粒徑為66nm，90%的粒徑小于128nm，粒徑比BSANP略為增大。_中國科技論文在線圖1 葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的透射電鏡照片 Figure 1 Transmission electron micrography of folate-conjugated bovine serum albumin nanoparticles (folate-BSANP) (×20000)2.2 Folate-BSANP偶聯(lián)程度的測定 5批folate-BSANP樣品表面

15、的葉酸偶聯(lián)量測定數(shù)值分別為172、176、162、163、172mol/gBSA，故其平均葉酸偶聯(lián)量為169mol/gBSA。作者采用2,4,6-三硝基苯磺酸顯色法3測定了BSANP的表面活性氨基的含量為598mol/gBSA，則偶聯(lián)于folate-BSANP表面的葉酸密度為28.3%。2.3 Folate-BSANP與BSANP的細胞攝取實驗納米粒濃度對SKOV3細胞攝取的影響見圖2，由圖可見隨著培養(yǎng)液中folate-BSANP濃度的增加，SKOV3細胞攝取folate-BSANP的量逐漸增加，但當(dāng)濃度大于1.0mg/ml后，增加緩慢。在極低濃度時，BSANP的細胞攝取量幾乎為零。圖2 納米

16、粒濃度對skvo3細胞攝取葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的影響Figure 2 Concentration dependence of Folate-BSANP uptake bySKOV3 cells培養(yǎng)時間對SKOV3細胞攝取的影響見圖3，隨著培養(yǎng)時間的延長，SKOV3細胞攝取folate-BSANP的量逐漸增加，在初始的2h內(nèi)，細胞攝取量增加迅速，在隨后的培養(yǎng)時間內(nèi)增加緩慢。圖3 培養(yǎng)時間對SKOV3細胞攝取葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的影響Figure 3 Time dependence of folate-BSANP uptake by SKOV3cells游離葉酸對SKOV3細胞攝取的影響見圖4，隨

17、著外源性葉酸的加入，SKOV3細胞對Folate-BSANP的攝取量逐漸減少，并最終接近BSANP的攝取量；而相同情況下，SKOV3細胞對BSANP的攝取曲線非常平緩。圖4 游離葉酸對SKOV3細胞攝取葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的抑制Figure 4 Inhibition of free folic acid on the uptake offolate-BSANP由圖5可以看到，SKOV3細胞與folate-BSANP 37培養(yǎng)3h后在熒光顯微鏡下可以看到明顯的熒光，而_中國科技論文在線SKOV3細胞與BSANP培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下基本上看不到熒光，說明SKOV3細胞攝入folate-BSANP的

18、量遠大于BSANP。AB圖 SKOV細胞與Folate-BSANP和BSANP培養(yǎng)3h后的熒光顯微鏡照片F(xiàn)igure 5 Fluorescence micrographs of SKOV3 cells incubated respectively with folate-BSANP and BSANP for 3h at 37(×400)A：folate-BSANP; B：BSANP3 討論受體和其配體的結(jié)合具有特異性、選擇性、飽和性、親合力強和生物效應(yīng)明顯等特點。利用配體為藥物或放射性核素的載體，通過受體介導(dǎo)作用，增加藥物在病灶局部的濃度、提高療效，降低毒副作用，達到靶向治療目的，

19、是目前研究最活躍的前沿領(lǐng)域之一。葉酸受體在多種腫瘤細胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和腎細胞癌等)膜上的高表達為通過葉酸受體介導(dǎo)藥物靶向于腫瘤細胞的研究奠定了基礎(chǔ)。我們先制備BSANP，利用葉酸活性酯與BSANP表面的活性氨基進行偶聯(lián)反應(yīng)，制備folate-BSANP，平均粒徑為66nm，偶聯(lián)于folate-BSANP表面的葉酸密度為28.3%。研究結(jié)果顯示folate-BSANP進入SKOV3細胞的量顯著高于BSANP，兩者攝入途徑不同。folate-BSANP被SKOV3細胞攝入的量隨濃度增大、時間延長而增加，但在濃度超過1.0mg/ml，時間超過2h后增加緩慢，表現(xiàn)出攝取過程具有濃度

20、和時間依賴的飽和特點；folate-BSANP攝入量隨SKOV3細胞培養(yǎng)介質(zhì)中游離葉酸濃度的增加而明顯降低，表現(xiàn)為葉酸對folate-BSANP的攝入具有競爭性抑制作用（在生理條件下，葉酸濃度一般不會超過20nmol/L，不會干擾folate-BSANP的攝取而影響靶向效果4）。由此可見，folate-BSANP是通過葉酸受體介導(dǎo)而進入SKOV3腫瘤細胞的。用作抗癌藥物載體是納米粒最有價值的用途之一。納米粒能從腫瘤的內(nèi)皮組織、血管中溢出而滯留在腫瘤內(nèi)，腫瘤的血管壁對納米粒有黏附性。納米級膠體顆粒在體內(nèi)的命運主要由它們的體積和表面特性決定。較小的體積(小于200nm)和親水性的表面可以減少調(diào)理反應(yīng)，從而使其不易被巨噬細胞吞噬5。我們采用親水性材料牛血清白蛋白制備的葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒平均粒徑為66nm，符合上述兩個條件，可以有效地逃避巨噬細胞的吞噬，到達腫瘤組織。白蛋白納米粒表面偶聯(lián)的葉酸分子可以和腫瘤細胞膜表面高表達的葉酸受體作用，有效地將藥物輸送到腫瘤細胞。利用葉酸受體在多種腫瘤細胞表面高表達的特點，使其具有主動靶向作用，以期提高白蛋白納米粒的腫瘤細胞攝取量。葉酸受體介導(dǎo)的白蛋白納米粒可用于治療卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌和腎細胞癌等多種腫瘤，具有誘人的應(yīng)用前景。本研究首次成功制備得到葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒，探討了其體外腫瘤細胞靶