外源性DNA殘留量檢測

1、 外源性DNA殘留量檢測1.目的描述外源性DNA殘余量檢定（地高辛法）的操作過程和注意事項(xiàng)。2.材料及設(shè)備2.1試劑試液無水乙醇。Tris飽和酚。三氯甲烷。異戊醇。吐溫20。20%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，用鹽酸調(diào)pH至7.2。0.2mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）。3mol/L醋酸鈉溶液。20×SSC溶液：0.3mol/L檸檬酸鈉,3mol/L NaCl,調(diào)pH至7.0。Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCI，用固體NaOH調(diào)pH7. 5)。Buffer (100mmo1/L Tris-HCl 100mmo1/L Na

2、CI, 50mmo1/LMgCl2，pH9. 5)。TE緩沖液（pH8.0)：量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2ml, 加滅菌水至1000ml。ECORI內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）BamHI內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）2.2材料和用具細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物）批號H6611瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物）批號I7908外源DNA殘留量檢測試劑盒（Roche）貨號：11745832910和1109365791尼龍膜（PALL 0.45微米）點(diǎn)樣器（Bio-RAD;Model No:Bio-Dot

3、 SF Cell;Serial No:160BR07680）、移液器、tip頭、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、冰盒、離心機(jī)、三維旋混儀、電磁爐3.操作原理用隨機(jī)啟動法，將地高辛甙元標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸摻入未標(biāo)記DNA，通過一個手臂將dUTP與載體半抗原地高辛甙元連接起來（dig-dUTP）。與目的DNA雜交后，雜交分子用酶聯(lián)免疫法檢測；應(yīng)用抗體酶聯(lián)接物（抗地高辛甙元堿性磷酸酶復(fù)合物）和隨后用酶促顏色反應(yīng)使5溴4氯3吲哚磷酸（BCIP）和氮藍(lán)四唑（NBT）顯色。流程圖探針效率確定酶切 獲得DNA片段 探針標(biāo)記 純化探針 基因組DNA提取 陽性DNA 變性DNA點(diǎn)膜預(yù)雜交 雜交過夜 樣品終止保存 顯色

4、抗體雜交 封閉 嚴(yán)謹(jǐn)洗滌4.操作過程4.1探針制備4.1.1提取后的基因組DNA用等體積的飽和酚溶液（飽和酚：三氯甲烷：異戊醇=25：24：1）混合均勻，12000rpm離心（4）5分鐘。輕輕吸取上層液體到另一EP管，在上清液中加入1/10體積3mol/L乙酸鈉，稍微震蕩或輕彈混勻，然后加入2倍體積（加入乙酸鈉后的體積）冰無水乙醇，混勻后置于-204小時或-702小時。12000rpm離心（4）5分鐘，棄液體，加入75%冰乙醇10000rpm離心（4）5分鐘，棄去液體，室溫晾干。加入適量無菌水或TE緩沖液，-20保存。4.1.2純化后的基因組DNA進(jìn)行酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收小片段

5、。取1g 回收DNA用滅菌雙蒸水加至16微升，然后放入沸水浴中將DNA變性，水浴10分鐘后，立即放入冰水浴中，冰浴5分鐘。4.1.3冰浴后加入試劑盒中的1#試劑5微升，輕輕彈動混勻，37培養(yǎng)過夜。4.1.4次日，將探針取出，向其EP管內(nèi)添加0.2mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）2微升，3mol/L醋酸鈉溶液2微升，無水乙醇50微升。4.1.5將EP管放于-70環(huán)境中2小時以上。4.1.6取出探針，15000rpm離心（4）15分鐘，傾倒上清，用50微升滅菌雙蒸水溶解探針，放于4環(huán)境中備用（不宜超過一周）。4.1.7 探針效率檢測，詳見試劑盒說明。試劑盒內(nèi)2#能顯示出0.1pg點(diǎn)，自

6、己所做探針僅顯示出1pg點(diǎn)。4.2供試品，陽性，陰性及對照處理 4.2.1用純化后的基因組DNA，稀釋梯度為10ng/100l、 1ng/100l、100pg/100l、10pg/100l，1pg/100l的陽性對照。陰性對照為稀釋液。4.2.2將供試品、陽性對照、陰性對照置100水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻5分鐘，以8000轉(zhuǎn)/分離心5秒甩水。4.3點(diǎn)膜及雜交4.3.1用抽濾加樣器將100l樣品全部點(diǎn)樣于的雜交膜上。4.3.2取下雜交膜，點(diǎn)樣面向上，置紫外燈下照射30分鐘。4.3.3取無菌培平皿，加10ml已預(yù)熱（37）雜交液，并將雜交膜全部浸泡于其中，置37水浴孵育30分鐘進(jìn)行預(yù)雜交。4

7、.3.4預(yù)雜交完畢后，倒掉預(yù)雜交液加入10ml新鮮預(yù)雜交液（50）及全部探針（探針置100水浴加熱10分鐘，冰浴5分鐘），然后置37水浴孵育過夜。4.4洗脫及顯色4.4.1低嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫：取無菌培養(yǎng)平皿，加10ml2X SSC（含0.1%SDS）,將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，洗次，每次5分鐘。4.4.2高嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫：取無菌培養(yǎng)平皿，加10ml0.5X(0.1%SDS)(68預(yù)熱),將雜交液全部浸泡其中，置68搖動，洗次，每次15分鐘。4.4.3平衡：取無菌平皿，加10mlBuffer1（含0.3%吐溫20）,將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床震蕩。4.4.4封閉：取一次性

8、無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferI稀釋過的封閉液，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床震蕩30分鐘。4.4.5抗體孵育：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferI稀釋過的封閉液，同時加入試劑盒中的4#試劑2微升，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，30分鐘。4.4.6洗脫：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferI（0.3吐溫20）,將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，15分鐘，次。4.4.7平衡：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferIII，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，分鐘。4.4.8顯色：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10ml BufferIII（含200l 5#），將雜交膜全部浸泡其中，室溫下避光靜置0.5小時以上至顯色完畢。4.4.9終止反應(yīng)：將雜交膜置無菌水中分鐘。4.4.10濕膜掃描、風(fēng)干并封膜。5.結(jié)果判定5.1陽性對照應(yīng)顯色，其顏色深度與DNA含量相對應(yīng)，呈一定顏色梯度。5.2陰性、空白對照應(yīng)不顯色，或顯色深度小于陽性DNA對照最低的稀釋度。5.3將供試品與陽性對照進(jìn)行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量。5.4 此次試驗(yàn)如僅試劑盒陽性對照可正常顯色（10pg清晰，1pg不明顯），自己所做陽性DNA未能顯