博苑生物-雙向電泳完整操作流程

1、雙向電泳完整操作流程儀器：Eppendorf 冷凍離心機(jī) (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter）、IPGhor 等電聚焦儀（GE Healthcare）、DALT-SIXSDS-PAGE電泳儀（GE Healthcare）、ImageScanner掃描儀（GE Healthcare）、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析軟件（GE Healthcare）、電子天平、分光光度計、旋渦混和器、PH計、真空冷凍干燥機(jī)、液氮、離心管、研缽- 1 -主要溶液配置：三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巰基乙

2、醇溶于100%丙酮 丙酮洗滌液：0.07%巰基乙醇溶于丙酮樣品裂解液：9mol/L尿素、4CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT樣品水化液：9mol/L尿素、4CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT、少量溴芬蘭定量染色液：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋白平衡緩沖液1：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，1%DTT，痕量溴酚蘭平衡緩沖液2：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=

3、8.8)、30%甘油、2%SDS，4%碘乙酰胺，痕量溴酚蘭12%SDS-PAGE凝膠溶液：12%丙烯酰胺、0.32%雙丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL（pH=8.8）、0.1%SDS、0.05%過硫酸銨、0.05%TEMED電泳緩沖液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封膠液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%瓊脂糖 考染固定液：12%（W/V）三氯醋酸考染染色液：0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。 考染漂洗液1：0.1mol/L Tris-H3PO4(P

4、H6.5)考染漂洗液2：25%甲醇 考染穩(wěn)定液：20%的（NH4）2SO4溶液銀染固定液：40%甲醇、10%乙酸銀染敏化液：30%甲醇、0.2%硫代硫酸鈉、6.8%無水乙酸鈉銀染染色液：0.25%硝酸銀銀染顯影液：0.25%碳酸鈉、0.04%甲醛溶液（37%，w/v）銀染停顯液：1.46%EDTA.Na2.2H2O- 2 -蛋白提?。阂?、細(xì)胞1、取大約5*107個細(xì)胞用PBS溶液懸浮清洗，1000g離心10min取沉淀并重復(fù)以上步驟兩次，收集沉淀于1.5ml離心管中，2、加入樣品裂解液，低溫超聲處理5min后轉(zhuǎn)入36水浴裂解1h，3、室溫15 000g離心15min，收集上清并再次離心，上清即

5、為提取的細(xì)胞總蛋白溶液，4、采用Bradford法Marion M. Bradford. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254測定提取的蛋白濃度，5、樣品分裝后儲存于-80備用或直接用于雙向電泳。二、動物組織1、將冷凍的動物組織樣品取出，加入液氮，充分研磨，2、將研磨后的組織溶解液于樣品裂解液中，36恒溫水浴裂解1h，充分溶解蛋白，3、室溫15000g離心15min，取上清，并再次離心取上清，充分去除不容性雜質(zhì)，上清即為提取的組織總蛋白溶液，4、采用Bradford法Marion M. Bradford. Analytical Biochemis

6、try, 1976, 72: 248-254測定提取的蛋白濃度，5、樣品分裝后儲存于-80備用或直接用于雙向電泳。三、微生物1、取一定量的微生物樣品，1000g離心10min取沉淀，2、在沉淀中加入液氮，充分研磨，3、加入預(yù)冷的三氯乙酸-丙酮沉淀液，充分混合后，20放置1h， 4、4，30000g離心16min，取沉淀，5、將沉淀采用預(yù)冷的丙酮洗滌液懸浮，20放置1h，4，30000g離心- 3 -16min取沉淀并重復(fù)該步驟一次，6、取沉淀真空冷凍干燥20min，使樣品成粉末狀，7、取粉末加入樣品裂解液，旋渦混合充分分散后置36恒溫水浴裂解1h，充分溶解蛋白，8、室溫15000g離心15mi

7、n，取上清，并再次離心取上清，充分去除不容性雜質(zhì)，上清即為提取的微生物總蛋白溶液，9、采用Bradford法Marion M. Bradford. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254測定提取的蛋白濃度，10、樣品分裝后儲存于-80備用或直接用于雙向電泳。四、植物組織1、取一定量的植物樣品，加入液氮，充分研磨，2、加入預(yù)冷的三氯乙酸-丙酮沉淀液，充分混合后，20放置1h， 3、4，30000g離心16min，取沉淀，4、將沉淀采用預(yù)冷的丙酮洗滌液懸浮，20放置1h，4，30000g離心16min取沉淀并重復(fù)該步驟一次，5、取沉淀真空冷凍干燥20m

8、in，使樣品成粉末狀，6、取粉末加入樣品裂解液，旋渦混合充分分散后置36恒溫水浴裂解1h，充分溶解蛋白，7、室溫15000g離心15min，取上清，并再次離心取上清，充分去除不容性雜質(zhì)，上清即為提取的微生物總蛋白溶液，8、采用Bradford法Marion M. Bradford. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254測定提取的蛋白濃度，9、樣品分裝后儲存于-80備用或直接用于雙向電泳。五、液體樣品1、取一定量的液體樣品，加入5倍體積的的預(yù)冷丙酮洗滌液沉淀，20放置1h，4，15000g離心15min取沉淀，- 4 -2、將沉淀真空冷凍干燥20m

9、in，3、取干燥后的樣品加入樣品裂解液，旋渦混合充分分散后置36恒溫水浴裂解1h，充分溶解蛋白，4、室溫15000g離心15min，取上清，并再次離心取上清，充分去除不容性雜質(zhì)，上清即為提取的微生物總蛋白溶液，5、采用Bradford法Marion M. Bradford. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254測定提取的蛋白濃度，6、樣品分裝后儲存于-80備用或直接用于雙向電泳。- 5 -蛋白定量1，取9支5ml離心管，按下表所列先于每管加入3ml蛋白染色液，在1-6管中分別加入0-100ul不等的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，另外三個管子分別加入10ul的待測

10、樣品，同時根據(jù)已加樣品體積補(bǔ)足裂解液至100ul，表1 馬斯亮蘭法實驗表格 管號 染色液標(biāo)樣(ul) 0 0 0 待測樣體積裂解液(ul)吸光值(595nm) 待填 待填1 待填 2 待填 4 待填 8 待填 10 待填 待填 待填 待填 待填 待填 蛋白濃度：2、加入所有溶液5分鐘后，待溶液顏色穩(wěn)定，采用分光光度計測定每管溶液在595nm下的吸光值，3、根據(jù)前6管溶液的吸光值和蛋白的濃度繪制蛋白含量與溶液吸光值的關(guān)系曲線，4、根據(jù)待測樣品溶液的吸光值以及關(guān)系曲線公式計算樣品濃度。- 6 -雙向電泳操作：一、等電聚焦：1、從冰箱中取出冷凍保存的蛋白溶液，室溫下充分融解，2、按表2所列取一定量的

11、蛋白樣品，并用樣品水化液補(bǔ)足體積至450ul，3、取出低溫保存的膠條（GE Healthcare），室溫下放置10min，4、在聚焦槽中緩慢加入蛋白樣品，5、去除膠條保護(hù)膜，分清膠條正負(fù)極，膠面朝下緩慢倒壓在蛋白溶液中，放置過程中如有氣泡產(chǎn)生，則可以緩慢拖動膠條以趕走氣泡，6、在膠條支持膜面緩慢加入2ml左右覆蓋油并蓋好聚焦槽蓋，7、準(zhǔn)備完畢后開始按如下參數(shù)設(shè)置等電聚焦程序。溫度：20最大電流：50A/strip等電聚焦程序：50V×12 h（step）、500V×1h（step）、1000V×1h（step）、1000-10000 V×1h（gradi

12、ent）、10000V×nh（step）、500V×nh（step）表2 常用膠條所需等電聚焦時間列表 染色方法范圍考染銀染上樣量(ug) 聚焦時間(vhours)注：膠條長度均為24cm，最高電壓為10000V二、膠條平衡及SDS-PAGE電泳：1、等電聚焦完成后，取出膠條，用半濕濾紙小心吸去膠條表面覆蓋油及多余蛋白溶液，2、將膠條放入10ml平衡緩沖液1中，室溫緩慢水平搖晃平衡15min，3、將經(jīng)過平衡緩沖液1平衡過的膠條轉(zhuǎn)移至10ml平衡緩沖液2中緩慢- 7 -水平搖晃平衡15min，4、將平衡好的膠條浸入SDS-PAGE電泳緩沖液中半分鐘，以利于膠條內(nèi)的蛋白充分進(jìn)入

13、第二向凝膠，5、在SDS-PAGE凝膠上表面加入處于融解狀態(tài)的低熔點瓊脂糖，6、將膠條放到第二向SDS-PAGE凝膠上表面，并用鑷子輕推膠條，使膠條與SDS-PAGE凝膠上表面充分接觸，7、待低熔點瓊脂糖完全冷凝后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳漕中進(jìn)行電泳：采用用Ettan-DALT-Six系統(tǒng)；水浴循環(huán)儀設(shè)定溫度為：15；電泳初始設(shè)置為100V× 1h，然后換成200V電壓電泳至溴酚蘭前沿剛好跑出凝膠，8、電泳結(jié)束后，輕撬玻璃板，小心取出凝膠轉(zhuǎn)入染色槽進(jìn)行染色。三、凝膠染色：（一）考馬斯亮蘭染色：參考Giovanni等G. Candiano, M. Bruschi, L. Musante, e

14、t al., Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis, Electrophoresis 25 (2004) 1327-1333 的方法進(jìn)行： 1、固定：采用固定液對凝膠內(nèi)蛋白進(jìn)行固定，時間為2小時，2、染色：采用考馬斯亮蘭染色液染色24小時，3、漂洗1：采用考染漂洗液1對染色后的凝膠進(jìn)行漂洗，時間為2分鐘，4、漂洗2：采用考染漂洗液2漂洗1分鐘，5、穩(wěn)定：采用考染穩(wěn)定液對漂洗后的凝膠進(jìn)行穩(wěn)定，時間為12小時，6、采用超純水漂洗凝膠1天左右至背景清晰。（二）硝酸銀

15、染色：參考Yan等J.X Yan, R. Wait, T. Berkelman, et al. Amodified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-massspectrometry, Electrophoresis 21, (2000) 3666-3672的方法進(jìn)行：1、超純水洗凝膠1分鐘，2、固定：固定液固定30分鐘，重復(fù)一次，3、增敏：敏化液敏化30min，4、清洗：純水，5min，3次，- 8 -5、銀染：銀染液染色30分鐘，6、清洗：純水，1分鐘，2次，7、顯影：顯影