實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎與細(xì)胞凋亡

1、實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎與細(xì)胞凋亡                 摘要： 實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是研究人類多發(fā)性硬化(MS)的 經(jīng)典動(dòng)物模型，EAE發(fā) 病和愈復(fù)過程中細(xì)胞凋亡的情況也是目前神經(jīng)生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。研究者們發(fā)現(xiàn)，EAE時(shí)CNS 損傷區(qū)有自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的凋亡，而且這種細(xì)胞凋亡促進(jìn)了EAE的愈復(fù)和耐受狀態(tài)的形 成，這就為EAE乃至人類MS的防治提供了一條新思路。有關(guān)EAE其他細(xì)胞 凋亡和影響細(xì)胞凋亡的因素也有

2、一些研究。本綜述對(duì)近年來這些方面的研究進(jìn)展做了較為 全面的回顧。 實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是T細(xì) 胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）脫髓鞘疾病，是人類脫髓鞘疾病 多發(fā)性硬化 （multiple sclerosis, MS）的經(jīng)典動(dòng)物模型。研究EAE的發(fā)病及愈復(fù)機(jī)制 ，對(duì)于MS的預(yù)防和治療都有重要意義。有關(guān)EAE發(fā)病機(jī)制的研究近年來有以下進(jìn)展：（1）介 導(dǎo)EAE發(fā)病的淋巴細(xì)胞更具體地歸類為CD4+V 8.2+T細(xì)胞；（2）淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞 因子如IL-2、

3、IL-4、IL-10、TNF、IFN-、TGF-等，直接參與炎癥反應(yīng)或反應(yīng)的修 復(fù)；（ 3）NO參與EAE的發(fā)病，但不同的研究者用不同的動(dòng)物和誘導(dǎo)方式以及不同的NOS拮抗劑，得 出不同結(jié)果1，2，因而NO的作用有待進(jìn)一步明確；（4）Fas/Fas-L系統(tǒng)促進(jìn)少 突 膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，參與EAE的發(fā)病3-6；（5）細(xì)胞凋亡(apoptosis)與EAE發(fā)病有 關(guān)，尤其在EAE的愈復(fù)和免疫耐受形成中起重要作用。 細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)的關(guān)系極為密切，淋巴細(xì)胞的凋亡涉及到自身免疫性疾病的康復(fù)及耐 受機(jī)制的形成。對(duì)于E提 （，。）AE也不例外。 早在60年代中期，就有人發(fā)現(xiàn)EAE病程中有細(xì)胞死亡，并認(rèn)為是少

4、突膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞和 淋巴細(xì)胞死亡。隨著凋亡概念的出現(xiàn)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，Pender等從形態(tài)學(xué)上證實(shí)EAE中的 細(xì)胞死亡以凋亡的形式出現(xiàn)，并認(rèn)為其中有少突膠質(zhì)細(xì)胞，而后又發(fā)現(xiàn)更多的凋亡細(xì)胞是T 淋巴細(xì)胞，還有一些為巨噬細(xì)胞7。這些研究成果激起學(xué)者們的濃厚興趣，促進(jìn) 了對(duì)此問題的深入探討。 目前，對(duì)凋亡淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步分類、影響凋亡的因素以及凋亡的意義等，都有了很多新的 發(fā)現(xiàn)。 1EAE中凋亡的細(xì)胞 1.1少突膠質(zhì)細(xì)胞Pender等在證實(shí)EAE病程中有細(xì)胞凋亡存在的同時(shí)發(fā) 現(xiàn)：凋亡細(xì)胞出現(xiàn) 在CNS的灰質(zhì)和白質(zhì)中；白質(zhì)中的凋亡細(xì)胞與正常的有髓纖維毗鄰，慢性EAE中則與脫髓鞘的 纖維毗鄰；灰質(zhì)中

5、的凋亡細(xì)胞與神經(jīng)元胞體和髓鞘毗鄰；在含有髓鞘碎片、毗鄰脫髓鞘軸突 的巨噬細(xì)胞中有凋亡的細(xì)胞體。前人也曾注意到，Cuprizone中毒小鼠CNS中正在死亡 的少突膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的染色質(zhì)邊集和核分裂，形成幾個(gè)大的致密團(tuán)塊。于是，根據(jù)凋亡細(xì) 胞的大小和位置，Pender等推測(cè)凋亡的細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞。但是，對(duì)于這種細(xì)胞的定性， 卻沒有更具說服力的證據(jù)。曾有人提出不同觀點(diǎn)，認(rèn)為EAE時(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞不是凋亡，而是 細(xì)胞溶解。用TUNEL技術(shù)檢測(cè)EAE的凋亡細(xì)胞，也未檢測(cè)到呈陽性反應(yīng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而 否定了少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡8。 1.2淋巴細(xì)胞Pender等雖然沒有為少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡提供更多的證據(jù)

6、，但在提出“EAE 的CNS中可能有特異性淋巴細(xì)胞的凋亡”后又進(jìn)行了一系列的研究。1992年他們使用包埋 前免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CNS中10%CD4+細(xì)胞和5% T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。而凋亡細(xì)胞中， 51%被OX-34標(biāo)記，38%被R73標(biāo)記。由此得出結(jié)論：急性MBP誘導(dǎo)的EAE,脊髓中的凋亡細(xì)胞至 少一半以上是T淋巴細(xì)胞，并很有可能是自身反應(yīng)性 的、MBP激活的特異性T淋巴細(xì)胞(即MBP -特異性T細(xì)胞)。其他研究者也發(fā)現(xiàn)，腦損傷區(qū)的凋亡細(xì)胞64%為T淋巴細(xì)胞。1994年他們?cè)?被動(dòng)轉(zhuǎn)移的EAE模型用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型和DNA，證實(shí)了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的凋亡 9。該研究發(fā)現(xiàn)，V 8.2+T細(xì)胞

7、在凋亡細(xì)胞中的比例是其在正常T淋巴細(xì)胞群中的 7倍，顯示出凋亡細(xì)胞中V 8.2+細(xì)胞的高度聚集，得出“自身反應(yīng)性V 8.2+T細(xì)胞 以凋亡的方式從靶器官中選擇性消除”的結(jié)論。在主動(dòng)誘導(dǎo)的EAE也得到類似的結(jié)果1 0。1995年他們使用有限稀釋法分析發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)轉(zhuǎn)移的EAE在發(fā)病高峰期脊髓中MBP-特 異性淋巴細(xì)胞，即V 8.2+T細(xì)胞達(dá)最高比例（1146個(gè)細(xì)胞中有1個(gè)）；到恢復(fù)期，其比 例則奇跡般地降至每105個(gè)細(xì)胞中1個(gè)；同時(shí)檢測(cè)的卵白蛋白(OVA)-特異性T淋巴細(xì)胞的比 例 ,在兩個(gè)時(shí)期改變程度較小11。這種恢復(fù)期V 8.2+T細(xì)胞特異性下調(diào)的現(xiàn)象 ，進(jìn)一步證實(shí)了前面的觀點(diǎn)9。1998年，他

8、們檢測(cè)了介導(dǎo)凋亡的蛋白，發(fā)現(xiàn)V 8 .2+細(xì)胞中，F(xiàn)as+和Fas-L+的細(xì)胞分別是V 8.2Fas+V 8.2Fas-L +細(xì)胞的1.45.8倍和1.58.8倍，說明V 8.2+細(xì)胞表達(dá)Fas 和Fas-L的頻率高 12，進(jìn)一步證實(shí)了“自身反應(yīng)性V 8.2+T細(xì)胞以凋亡的方式從靶器官中選擇 性消除”。其他學(xué)者用免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)，在被動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE的SJL/J雌性小鼠也證實(shí)了CN S中T淋巴細(xì)胞? （實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎與細(xì)胞凋亡(2) 牡蟯觶?。 Pender等檢測(cè)了外周淋巴器官，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)誘導(dǎo)的EAE淋巴結(jié)中也有凋亡細(xì)胞的存在，但數(shù)量 較少，主要局限于生發(fā)中心，即B細(xì)胞區(qū)。檢測(cè)MBP-

9、特異性T淋巴細(xì)胞在被動(dòng)轉(zhuǎn)移EA E的腸系膜淋巴結(jié)中的比例同樣發(fā)現(xiàn)，癥狀明顯時(shí)凋亡細(xì)胞比例較高，恢復(fù)期及恢復(fù)后比例 逐漸降低，直至檢測(cè)不出11。MBP-特異性T細(xì)胞受體的轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺中也有 V 8.2+ T細(xì)胞的凋亡13。尚未看到關(guān)于脾內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡的報(bào)道。 1.3巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞有研究者發(fā)現(xiàn)，一些非淋巴細(xì)胞的凋亡細(xì)胞， 胞漿豐富，含有 脂滴、空泡和吞噬的髓鞘碎屑，認(rèn)為是巨噬細(xì)胞，并在電鏡下得到證實(shí)7。Bruno Bonetti等采用免疫細(xì)胞化學(xué)和TUNEL技術(shù)，在被動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE急性期的小鼠中觀察到環(huán)繞血管 周隙的一些小膠質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生凋亡，但所占比例較低14。后來證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì) 胞比巨噬細(xì)胞

10、更易于凋亡15。 2EAE中細(xì)胞凋亡的機(jī)制和影響因素 研究者們?cè)诖_定EAE的CNS中有MBP-特異性淋巴細(xì)胞的凋亡后提出細(xì)胞凋亡的幾種可能機(jī) 制：(1)效應(yīng)性T細(xì)胞完成功能后內(nèi)源性程序引發(fā)的自我毀滅過程。但這一機(jī)制的可能性不大 ，因?yàn)榧?xì)胞毒T細(xì)胞殺靶后可以再循環(huán)。(2)對(duì)致腦炎性T細(xì)胞有特異性定靶作用的 T細(xì)胞產(chǎn) 生的細(xì)胞毒性（溶細(xì)胞性細(xì)胞間的相互作用）。(3)內(nèi)源性皮質(zhì)醇的釋放。這一機(jī)制被廣泛 認(rèn)可，并通過腎上腺切除后的EAE大鼠，觀察到CNS內(nèi)T細(xì)胞凋亡數(shù)量減少16而得 到進(jìn)一步的證實(shí)。(4)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。后來進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EAE恢復(fù)期間和恢復(fù)后， 脫髓鞘病變釋放的MBP增多，小膠

11、質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MHC-類抗原也增多，致使新進(jìn)入CNS的T細(xì)胞 被激活，而此時(shí)V 8.2+T細(xì)胞凋亡比例也升高12，為這一機(jī)制提供了證據(jù)。 影響細(xì)胞凋亡的因素還很多，其中CNS的內(nèi)部環(huán)境就是一個(gè)重要因素，因?yàn)檠芯恐邪l(fā)現(xiàn)T淋 巴細(xì)胞的凋亡僅限于CNS的實(shí)質(zhì)。CNS的局部因素包括傳導(dǎo)信號(hào)的失衡,細(xì)胞毒因子（TNF- 、淋巴毒因子）、腦特異性激素和細(xì)胞毒T細(xì)胞的相互作用。此外，學(xué)者們認(rèn)為腦內(nèi)的星形 膠質(zhì)細(xì)胞和部分小膠質(zhì)細(xì)胞也能促使T細(xì)胞凋亡14。至于其機(jī)制，可能是由于星 形膠質(zhì)細(xì)胞和部分小膠質(zhì)細(xì)胞屬于非專一性抗原遞呈細(xì)胞，缺乏協(xié)同刺激信號(hào)所致 ，屬于激 活誘導(dǎo)的凋亡。另外，過量的NO通過誘導(dǎo)型 NOS (

12、iNOS) 在T細(xì)胞的凋亡中起重要作用 17。體外研究也證實(shí)，活性氧和NO能誘導(dǎo)MBP-特異性T淋巴細(xì)胞的凋亡18 。 巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制及影響因素與淋巴細(xì)胞類似7，但無Fas/Fas-L的參與 15?，F(xiàn)只了解小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡不通過Fas/Fas-L途徑15（這與有些學(xué)者         的觀點(diǎn)8不太一致），其余無更多的闡述。 3EAE中細(xì)胞凋亡的意義 很早就有人提出，淋巴細(xì)胞的克隆清除可能是EAE愈復(fù)和耐受的機(jī)制。現(xiàn)已十分肯定，這 種淋巴細(xì)胞的“克隆清除”是以凋亡的形式發(fā)生的，并有大量研究提供了證據(jù)，證實(shí)細(xì)胞凋

13、亡在EAE愈復(fù)和耐受形成中的作用。 研究者聯(lián)合使用光鏡、免疫電鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)、原位缺口翻譯等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，EAE早期 階段細(xì)胞凋亡較少，臨床恢復(fù)時(shí)達(dá)到高峰，而此時(shí)損傷區(qū)中49%的T細(xì)胞凋亡了。在被動(dòng)轉(zhuǎn)移 的EAE，也有類似的發(fā)現(xiàn)9。這些除了提示人們淋巴細(xì)胞的清除與EAE的恢復(fù)有關(guān) 外，還能解釋以往的一些發(fā)現(xiàn):CNS損傷區(qū)無髓磷脂-特異性T淋巴細(xì)胞的積累；外周血中這 種 特異性淋巴細(xì)胞比CNS多；MS患者緩解期外周血中髓磷脂自身免疫性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與正常 人無明顯不同。近年來，用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞分析檢測(cè)介導(dǎo)凋亡的蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證 了細(xì)胞凋亡與EAE臨床恢復(fù)的一致性12，即Fas+和Fa

14、s-L+細(xì)胞自發(fā)病初期開 始逐漸升高，恢復(fù)初期達(dá)高峰，而Bcl-2+細(xì)胞在整個(gè)病程中 ( 實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎與細(xì)胞凋亡(3) 變化不明顯。 對(duì)于急性EAE,CNS中 T細(xì)胞的凋亡與臨床愈復(fù)的關(guān)系基本明確，而與人類MS更為相似的慢性 - 復(fù)發(fā)性EAE又如何呢？有人在相同條件下，同時(shí)檢測(cè)急性EAE和慢性-復(fù)發(fā)性EAE病程中細(xì)胞 凋 亡的情況，并進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示慢性-復(fù)發(fā)性EAE首次發(fā)作和再次發(fā)作時(shí)細(xì)胞凋亡情況 與急性EAE類似：發(fā)病初期出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，然后凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，到恢復(fù)初期達(dá)高 峰，隨后又逐漸減少，幾乎減少至零；再次發(fā)作時(shí)，凋亡細(xì)胞又逐漸增加，復(fù)發(fā)高峰時(shí)其數(shù) 量也達(dá)高峰，然后

15、又再次減少14。 近年來，又有學(xué)者在堿性髓鞘蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞受體的轉(zhuǎn)基因小鼠EAE恢復(fù)階段發(fā)現(xiàn)CNS 中MBP-特異性T淋巴細(xì)胞的凋亡13，從而更明確了自身反應(yīng)性T 細(xì)胞以凋亡的方式自CNS清除是EAE愈復(fù)的機(jī)制之一。 EAE的CNS中淋巴細(xì)胞以凋亡方式發(fā)生的選擇性清除，有助于減少M(fèi)BP-特異性淋巴細(xì)胞的產(chǎn) 生。但由于淋巴結(jié)內(nèi)的前體能產(chǎn)生新的效應(yīng)細(xì)胞，因而CNS內(nèi)T淋巴細(xì)胞的急性清除不會(huì)產(chǎn)生 長(zhǎng)期耐受，而持續(xù)、低水平的凋亡則有助于耐受狀態(tài)的形成。通過后來的研究又進(jìn)一步提出 ，激活誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡可能有助于機(jī)體在急性EAE后進(jìn)入耐受狀態(tài)12。但這種 耐受狀態(tài)只針對(duì)再次用抗原和佐劑主動(dòng)誘導(dǎo)的方式，

16、而對(duì)于被動(dòng)轉(zhuǎn)移MBP-特異性淋巴細(xì)胞 則不起作用。 此外，CNS內(nèi)T淋巴細(xì)胞的凋亡還能盡可能減少腦損傷區(qū)以外的其他損傷。 巨噬細(xì)胞的凋亡在EAE的臨床愈復(fù)中也有助于CNS炎癥的消退，對(duì)緩解這一自身免疫性疾 病很重要7。少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡或損傷則在EAE的發(fā)病中起重要作用5 。 綜上所述，EAE病程中自身反應(yīng)性、CD4+V 8.2+T淋巴細(xì)胞以凋亡的方式從CNS清除， 是EAE愈復(fù)和耐受狀態(tài)形成的機(jī)制之一。根據(jù)這一結(jié)論，再結(jié)合EAE時(shí)CNS中淋巴細(xì)胞凋亡的 影響因素，就為我們通過治療EAE進(jìn)而治療人類的MS，提供了一個(gè)新的方案。我們相信， 在不久的將來，長(zhǎng)期困擾人類的慢性自身免疫性脫髓鞘疾病多發(fā)

17、性硬化的治療和預(yù)防復(fù) 發(fā)將會(huì)有新的突破。 參考文獻(xiàn)： 1Zielasek J, Jung S, Gold R, et al. Adm inistration of nitric oxide synth ase inhibitors in experimental autoimmune neuritis and experimental autoimmun e encephalomyelitisJ. J neuroimmunol, 1995,58：81-88. 2Cross AH, Misko TP, Lin RF, et al. Aminoguanidi ne, an inhibitor of

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