淮山藥多糖的免疫調節(jié)作用研究

1、淮山藥多糖的免疫調節(jié)作用研究              作者：徐增萊，汪瓊，趙猛，徐琴，賈成森，史云云【摘要】  目的探討淮山藥粗多糖對小鼠的免疫調節(jié)作用。方法小鼠灌胃給予不同劑量（200，400和800 mg/kg）的淮山藥多糖，1次/d，連續(xù)8 d，進行ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗（MTT法）、測定血清溶血素測定（半數(shù)溶血值法）、小鼠碳廓清實驗。結果山藥多糖具有增強小鼠淋巴細胞增殖能力的作用，促進小鼠抗體生成的作用和增強小鼠碳廓清能力的作用。結

2、論淮山藥多糖具有一定的免疫功能增強作用。 【關鍵詞】  淮山藥；多糖；免疫調節(jié)Abstract：ObjectiveTo investigate the immunologic enhancement of Dioscorea opposita Thunb.polysaccharide.MethodsDioscorea opposita Thunb.polysaccharide in different dosages(200,400,800 mg/kg)were given by IG for 8 d.A series of tests were carried out,such a

3、s the spleen lymph cells transformation of Con A inducing method (MTT method),hemolytic test of blood serum and hem chrome and mouse carbon test.ResultsThe results showed that Dioscorea opposita  Thunb.polysaccharide was significant to Con A induced mice Lymphocyte transformation test；HC50 rais

4、ed in all three concentrations;ratio of monocyte-macrophage carbon grain elimination has significant changes to the control.ConclusionDioscored opposita Thunb.polysaccharide possesses a potential effect of immune regulation.Key words：Dioscorea opposita Thunb.;  Polysaccharide;  Immunity mo

5、deration    山藥屬常用中藥，味甘、性平，具有補脾養(yǎng)胃、生津益肺、補腎澀精等作用。山藥多糖Dioscorea opposita Thunb.polysaccharide是從山藥中分離提純的水溶性多糖成分，具有免疫調節(jié)作用。以往有關山藥的藥理研究多針對河南省出產的鐵棍山藥和太谷山藥等懷山藥品種。而山藥在全國大部分地區(qū)均有栽培，淮山藥為其在淮河中下游地區(qū)（江蘇、安徽兩省北部）傳統(tǒng)栽培品種。以食用為主，兼作藥用。對淮山藥等山藥地方品種的藥理作用至今仍缺乏研究。為了充分利用淮山藥資源，本實驗研究了江蘇產淮山藥粗多糖對小鼠的免疫調節(jié)作用。1  材料1.1

6、  樣品淮山藥Disoscorea oppostita Thunb.來源：淮山藥采自江蘇省灌南縣花苑鄉(xiāng)。    將淮山藥削皮切片，曬干后粉碎，干燥后稱取粗粉（60目）900.0 g，加入適量蒸餾水在水浴中浸提，其間不斷攪拌，靜置冷卻后離心（3 000 r/min，5 min）除去不溶物，收集上清液，減壓濃縮。在冷卻后的上清液中加入95%乙醇至醇含量在80%以上，不斷攪拌，有大量沉淀生成，離心，收集沉淀，分別用無水甲醇和乙醚洗滌，以除去水分和雜質，得到灰白色粉末狀粗多糖38.88 g(1 g粉末相當于生藥23.14 g)。粗多糖得率可以達到4.32%，該粗

7、多糖中含有18.43% 的山藥多糖。1.2  動物和細胞ICR種小鼠1822 g，雄性，中國科學院上?？巳R斯實驗動物中心，合格證號：SCXK（滬）2003-2004。豚鼠，由江寧青龍動物養(yǎng)殖場提供，動物使用許可證號：（蘇）2002-0057。所有實驗動物均食用全價顆粒飼料，自由攝食飲水。YAC-1細胞，由南京中醫(yī)藥大學海洋中心藥理毒理室提供。1.3  綿羊紅細胞（SRBC）與補體制備健康綿羊頸脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動，以脫纖維，用阿氏液保存于4冰箱保存?zhèn)溆?。用時生理鹽水2000 r/min離心10 min洗滌3遍。  

8、60; 采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清），前將1 ml壓積SRBC加入到5 ml豚鼠血清中，放4冰箱30 min，經常振蕩，離心取上清，分裝小瓶，-70保存。用時以生理鹽水按110稀釋。2  方法    小鼠隨機分為對照組（給予蒸餾水）及山藥多糖200，400，800 mg/kg1 3個劑量組，每組10只。灌胃體積0.1 ml/10 g體重，1次/d，連續(xù)8 d。2.1  C onA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗1640培養(yǎng)液用微孔濾膜過濾除菌，加入10%小牛血清、1%谷氨酰胺（200 mg/ml）、青霉素（100 mg/ml）、鏈

9、霉素（100 mg/ml）及2-巰基乙醇（5 mol/ml），用無菌HC1（1 mol/L）或無菌NaOH（1 mol/L）調pH至7.07.2，制成完全培養(yǎng)液；用7.27.4的PBS緩沖液作溶劑，現(xiàn)用現(xiàn)配MTT溶液（5 mg/ml）；以3.5%的無菌NaHCO3將無菌Hansks液pH調至7.27.4；用雙蒸水配制成100 g/ml的ConA液，過濾除菌后，-20保存；在96 ml異丙醇中加入4 ml HCl（1 mol/L）制成酸性異丙醇溶液。各組動物連續(xù)灌胃至第8天，每鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用攝子輕輕將脾撕碎，制成單個細胞懸液，200目過濾，用H

10、anks液多次洗滌、離心后懸浮于2 ml完全培養(yǎng)液中，用臺酚染色計活細胞，調整細胞濃度為2×106個/ml，分兩孔放入培養(yǎng)孔中，每孔1 ml，一孔加50 l ConA液，另一孔作為對照，置5%CO2，37培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，同時加入50 mlMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束，每孔加入1 ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解，移入1 ml比色杯中，于分光光度計，570 nm處測定光密度2。 2.2  血清溶血素測定半數(shù)溶血值（HC50）的測定各組動物連續(xù)灌胃至3 d時，每鼠腹腔

11、注射2%（v/v）綿羊紅細胞懸液0.2 ml。5 d（期間不停止灌胃）后，小鼠經眼眶取血于離心管中，放置1 h，3 500 r/min離心15 min，收集血清，血清用生理鹽水緩沖液稀釋320倍。將稀釋后血清1 ml置試管內，依次加入10%（v/v）SRBC 0.5 ml，補體1 ml（用生理鹽水按110稀釋），另設不加血清的對照管（以生理鹽水代替）。置37恒溫水浴中保溫30 min后，冰浴終止反應。2 000 r/min離心10 min。取上清液1 ml，都氏試劑3 ml于試管內，同時取10%（v/v）SRBC 0.25 ml加都氏試劑至4 ml，于另一支試管內，作為SRBC的半數(shù)溶血值。充

12、分混勻，放置10 min后，于540 nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值2。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計算：  各小鼠的半數(shù)溶血值（HC50）=樣品管光密度SRBC半數(shù)溶血時的光密度×稀釋倍數(shù)2.3  小鼠碳廓清實驗將印度墨汁用生理鹽水稀釋4倍制成用墨汁，稱取1.0 gNa2CO3加蒸餾水至1 000 ml配置成0.1%Na2CO3溶液。各組動物連續(xù)灌胃至8 d時，每鼠尾靜脈注入注射用墨汁（0.1 ml/10 g?bw），注入后立即計時，于注入后0.5 ，6 min分別從內眥靜脈叢取血20 l，加到2 ml Na2CO3溶液中，用分

13、光光度儀計在600 nm波長處測光密度值，以Na2CO3溶液作為空白對照。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重3。按下列公式計算廓清指數(shù)K：    廓清指數(shù)K=（logOD50-logOD6）/(t6-t0.5)2.4  數(shù)據(jù)統(tǒng)計計量資料用（±s)表示，各組間實驗數(shù)據(jù)的比較采用兩樣本均數(shù)t 檢驗，P0.05有顯著差異。3  結果3.1  ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗（MTT法）用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力。結果如下。表1  淮山藥多糖對小

14、鼠淋巴細胞增殖能力的影響(略)    以上結果表明山藥多糖400，800 mg/kg劑量時，具有增強小鼠淋巴細胞增殖的能力的作用。3.2  血清溶血素的測定實驗（HC50法）結果見表3。表3  淮山藥多糖對小鼠血清溶血素的影響(略)    以上結果表明淮山藥多糖各劑量都具有促進小鼠抗體生成的作用。3.3  小鼠碳廓清實驗結果見表4。表4  淮山藥多糖對小鼠碳廓能力的影響(略)    以上結果表明淮山藥多糖800 mg/kg劑量時，具有增強小鼠碳廓清能力的作用。4  討論    本研究測定了淮山藥粗多糖對小鼠免疫功能的影響。結果顯示淮山藥粗多糖對能增強小鼠淋巴細胞