隱球菌保護(hù)性肽表位GMFDGLSGV多聚體的免疫原性研究

1、隱球菌保護(hù)性肽表位GMFDGLSGV多聚體的免疫原性研究              作者：谷明莉，錢琤，周曄，陳波，陳孫孝，鄧安梅，仲人前  【摘要】  目的 探討純化的隱球菌抗原肽GMFDGLSGV二聚體、四聚體、八聚體重組蛋白激發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應(yīng)答的能力，為新型隱球菌疫苗的研制打下基礎(chǔ)。方法 通過細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，研究純化的GMFDGLSGV單體、二聚體、四聚體、八聚體重組

2、蛋白刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生的增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒活性，初步鑒定重組多聚體的免疫原性。結(jié)果 10例HLAA*0201陽性個(gè)體PBMC對(duì)八聚體的平均SI為37.4±3.07；增殖反應(yīng)明顯高于四聚體（平均SI為20.1±1.37）、二聚體（平均SI為14.1±1.06）、單體（平均SI為11.4±0.68）以及陰性對(duì)照（平均SI為1±0.10）引起的細(xì)胞增殖反應(yīng)(P0.01)。在抗原肽誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒活性中，HLAA*0201陽性個(gè)體PBMC對(duì)八聚體、四聚體、二聚體、單體及陰性對(duì)照組均表現(xiàn)不同程度的殺傷活性，平均活性分別為48.1

3、7;4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1.0±0.1(P0.01)。結(jié)論 本研究得到的重組優(yōu)化八聚體具有較好的免疫原性，能有效刺激PBMC產(chǎn)生細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒活性，為進(jìn)一步開發(fā)有效的隱球菌疫苗打下了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  結(jié)核分枝桿菌 多聚體 疫苗Investigation of Immunogenicity of Multimer Peptides from MtbAbstract： Objective  To investigate immunogenicity of multimer pep

4、tides from mycobacterium tuberculosis (Mtb).Methods  Cellular proliferation and cytotoxicity experiments were performed to evaluate the immunogenicity of recombinant multimer peptides from Mtb. Results  Multimer peptides (10 ) could stimulate proliferation of peripheral blood monocytes (PB

5、MCs) from all of 14 HLAA*0201 positive (A2+) PPD+ healthy candidates, strikingly stronger than those of single peptides and PPDs groups (average stimulation index as 37.4±3.07 versus 20.1±1.37 or 14.1±1.06 or 11.4±0.68 or 1±0.10, respectively, P0.01). CTLs induced by multime

6、r peptides were used as effector cells in a CTL assay against T2 cells loaded with single peptide (10 ). Multimer peptides could induce CTL cytotoxic activity in all of the 14 A2+PPD+ healthy candidates, significantly stronger than single peptides and PPDs groups (average activity as 48.1±8.9%

7、versus 23.9±9.2% or 16.3±7.8% or 13.1±8.4% or 1±10%, respectively, P0.01). Conclusion  The recombinant octamerous peptide from Mtb can stimulate greater proliferation and cytotoxicity of PBMCs, which is helpful for designing new vaccine.Key  words： mycobacterium tubercu

8、losis; multimer peptide; vaccine在隱球菌感染中，隱球菌性腦膜炎的發(fā)病率近年來呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，且易發(fā)于細(xì)胞免疫功能受損的人群12。由于其病狀重、病死率高等特點(diǎn)，已引起臨床醫(yī)生的高度重視。在艾滋病患者中，并發(fā)新生隱球菌感染率高達(dá)30%，是愛滋病患者最主要的死亡原因之一。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和患癌癥的病人隱球菌的感染率也在急速攀升。雖然抗隱球菌的保護(hù)性免疫機(jī)制目前仍不清楚，但細(xì)胞免疫尤其是循環(huán)及感染部位的T細(xì)胞免疫起重要作用56。體內(nèi)持續(xù)存在的抗原引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的大量抗原特異性T細(xì)胞是機(jī)體免疫性保護(hù)作用的基礎(chǔ)。因此PBMCs對(duì)隱球菌抗原的應(yīng)答

9、，可作為研究抗隱球菌保護(hù)性免疫的良好模型。HLAA*0201在多數(shù)人群中普遍存在，其頻率40%。因此，進(jìn)行隱球菌抗原HLAA*0201限制性T細(xì)胞表位疫苗的研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義78。本研究采用HLAA*0201陽性個(gè)體的PBMC對(duì)候選表位或抗原的免疫反應(yīng)性來驗(yàn)證其免疫原性，探討純化的隱球菌抗原肽重組多聚體激發(fā)CTL免疫應(yīng)答的能力，為抗隱球菌疫苗的設(shè)計(jì)打下基礎(chǔ)。為了更加有效地達(dá)到預(yù)防和治療目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了含有可引導(dǎo)表位肽進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞的“木馬肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采取了高爾基體內(nèi)固有肽酶furin識(shí)別序列作為表位接頭的“串珠式” GMFDGLSGV多聚體。1  材料與

10、方法1.1  研究對(duì)象  10例HLAA*0201陽性志愿者，10例HLAA*0201陰性志愿者，留取外周血20 ml，肝素抗凝。1.2  試劑和試劑盒  FITC標(biāo)記的抗CD3、抗CD8、抗HLAA2流式單克隆抗體均為Caltag公司產(chǎn)品；時(shí)間分辨熒光DELFIA細(xì)胞增殖（AD0200）與細(xì)胞毒性（AD0016）檢測(cè)試劑盒均購自Wallac Oy公司；HLAA2高分辨SSPPCR試劑盒購自O(shè)ne Lamda公司； LPS、人重組IL2、人重組GMCSF、人重組IL4購自R&D公司； T2細(xì)胞株由上海長(zhǎng)征醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)診斷科保存。1.3 

11、 重組表位肽的制備  選取隱球菌抗原表位GMFDGLSGV，引入Th表位PADRE及木馬肽序列(RKKRRQRRR)，并以RVKR序列作為接頭，分別合成隱球菌保護(hù)性肽表位GMFDGLSGV二聚體、四聚體、八聚體全基因序列，經(jīng) PCR擴(kuò)增后分別插入融合表達(dá)載體pGEX4T1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步經(jīng)GST親合層析柱純化，得到重組表達(dá)蛋白，方法參見文獻(xiàn) 182185。1.4  HLA分型  先以鼠抗人HLAA2單克隆抗體（BB7.2）進(jìn)行HLAA2流式細(xì)胞儀初步篩選，然后再以HLAA2高分辨SSPPCR試劑盒進(jìn)一步確認(rèn)其A*020

12、1亞型。1.5  抗原肽誘導(dǎo)CTL制備  用密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞，種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 5%CO2孵育1.5 h。收集懸浮細(xì)胞，以10%二甲亞砜90%小牛血清保存于液氮備用。貼壁細(xì)胞為抗原提呈細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(DC)前體細(xì)胞，補(bǔ)充含GMCSF(1 000U/ml)、IL4(1 000 U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，37 5%CO2培養(yǎng)7 d 促其轉(zhuǎn)化，需要時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。5 d 后，加入LPS(1g/ml)培養(yǎng)2 d 后促進(jìn)DC成熟，照射使其失去增殖活性。將經(jīng)過照射的DC分別與抗原肽、多

13、聚體、HLAA*0201陽性(10 mol/L)在培養(yǎng)液中，37 5%CO2共孵過夜。分別將1×105負(fù)載的DC與1×106自體PBMC種于含10%FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 5%CO2混合培養(yǎng)3 d 后，加入rIL2(20 U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)10 d，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活性檢測(cè)。1.6  細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)   細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間分辨熒光DELFIA細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒。分別將經(jīng)輻射的5×103負(fù)載的APC 100 l 與5×104抗原誘導(dǎo)的自體CTL100 l 種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（以空

14、載的APC作為陰性對(duì)照），與20 l  BrdU應(yīng)用液共孵10 h，離心洗1遍，加入Eu標(biāo)記的抗BrdU單抗室溫孵育2 h，洗滌、固定后，經(jīng)時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度值。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取其平均值為檢測(cè)結(jié)果。刺激指數(shù)（SI）=含抗原肽的平均熒光強(qiáng)度值/陰性對(duì)照平均熒光強(qiáng)度值，將SI2的抗原肽視為能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖。         1.7  細(xì)胞毒性分析  以抗原肽誘導(dǎo)CTL為效應(yīng)細(xì)胞(E)，負(fù)載抗原肽的T2細(xì)胞作為靶細(xì)胞(T)，采用時(shí)間分辨熒光DELFIA細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)其殺

15、傷活性。參照說明書進(jìn)行操作，共培養(yǎng)4 h，最后檢測(cè)樣本熒光值。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取其平均值為檢測(cè)結(jié)果。細(xì)胞殺傷活性（%）=（待測(cè)孔熒光強(qiáng)度值-自然釋放孔熒光值）/（最大釋放孔熒光強(qiáng)度值-自然釋放孔熒光值）×100%。1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  統(tǒng)計(jì)處理采用SAS 6.12 軟件，用t檢驗(yàn)分析計(jì)量資料，P0.01認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  抗原肽刺激細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果  以細(xì)胞增殖反應(yīng)評(píng)價(jià)多聚體誘導(dǎo)PBMC中抗原特異性CTL應(yīng)答水平。結(jié)果表明，10例HLAA*0201陽性個(gè)體PBMC對(duì)八聚體的平均SI為37.4±

16、3.07；增殖反應(yīng)明顯高于四聚體（平均SI為20.1±1.37）、二聚體（平均SI為14.1±1.06）、單體（平均SI為11.4±0.68）以及陰性對(duì)照（平均SI為1±0.10）引起的陽性增殖反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)分析P0.01。而在HLA-A*0201陰性個(gè)體對(duì)照組中八聚體、四聚體、二聚體、單體及陰性對(duì)照也產(chǎn)生不同程度的陽性增殖反應(yīng)， SI分別為4.3±0.26、3.8±0.30、3.2±0.29、2.4±0.19、1±0.10未出現(xiàn)顯著的增殖反應(yīng)（見圖1）。圖1  重組多聚體可刺激較強(qiáng)的PBMCs增殖

17、反應(yīng)（略）2.2  抗原肽誘導(dǎo)的CTL殺傷毒性  HLAA*0201陽性個(gè)體PBMC對(duì)八聚體、四聚體、二聚體、單體及陰性對(duì)照均表現(xiàn)出不同程度的殺傷活性，平均活性分別為48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1±0.1，統(tǒng)計(jì)分析P0.01。而在HLAA*0201陰性個(gè)體對(duì)照組中，PBMC對(duì)八聚體、四聚體、二聚體、單體及陰性對(duì)照均表現(xiàn)出不同程度的殺傷活性，分別為5.2±0.50、4.8±0.41、4.1±0.35、3.4±0.25、1±0.

18、1（見圖2）。圖2  重組多聚體誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性CTL殺傷活性（略）3  討論   目前，對(duì)隱球菌感染的治療依然主要停留在兩性霉素B、5氟胞嘧啶和氟康唑等治療方案上。雖然兩性霉素B是系統(tǒng)性抗真菌治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其毒性作用顯著及治療時(shí)間長(zhǎng)等弊端，不僅限制了肝腎功能不全的病人應(yīng)用治療，也無法長(zhǎng)期用于正常患者的治療?？乖瑿D8+T細(xì)胞能分泌IFN和TNF等細(xì)胞因子。而在隱球菌感染的器官中輸入CD8+T細(xì)胞，可明顯減少該器官中隱球菌數(shù)量，證明CD8+T細(xì)胞具有很好的保護(hù)性作用10。   CTL在控制細(xì)胞內(nèi)病原菌感染和腫瘤中有著重要的

19、作用11，其中TCR肽MHC復(fù)合物是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，設(shè)計(jì)有效激發(fā)CTL免疫應(yīng)答的疫苗，可用于預(yù)防和治療感染和腫瘤等疾病。CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中，胞內(nèi)蛋白被降解成多肽，由TAP復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)一步被修飾為適合MHC分子結(jié)合的810 aa片段并結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外與TCR結(jié)合。因此CTL表位形成需要抗原能進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)生蛋白降解過程，胞內(nèi)合成的蛋白易于被蛋白酶降解，而絕大多數(shù)外源性蛋白則不能。所以由蛋白質(zhì)組成的疫苗通常能有效激發(fā)較強(qiáng)的抗體和Th免疫應(yīng)答，而誘發(fā)CTL應(yīng)答能力較弱。   為了獲得高效而特異的保護(hù)性CTL免疫應(yīng)答，我們對(duì)單純的CTL表位疫苗進(jìn)行三方面的改造：（

20、1）引入廣譜高效的Th表位PADRE(Poly Alamine DR Epitope)來改善Th細(xì)胞的功能狀態(tài)，以達(dá)到增強(qiáng)特異性CTL免疫應(yīng)答。（2）引入來源于HIVI Tat 的木馬肽（Trojan peptide，TA）序列(carrier)作為“向?qū)蛄小奔铀倌康目乖慕到饧疤岢?。TA可以轉(zhuǎn)運(yùn)含有T細(xì)胞表位的多肽至APC胞內(nèi)，形成能被CTL識(shí)別的細(xì)胞表面肽/MHC復(fù)合物。（3）采用高爾基體固有肽酶furin識(shí)別基序作為表位間的接頭，furin參與分泌途徑中TAP非依賴性CTL表位處理，識(shí)別RX(R/K)R基序，從而保證各表位有效的釋放和遞呈281287。采用TA技術(shù)比重組病毒、質(zhì)?；虻鞍?/p>

21、更為簡(jiǎn)單。該技術(shù)是通過轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu)直接進(jìn)入APC，以TAP非依賴機(jī)制形成CTL表位。在分泌途徑中，高爾基體固有肽酶furin已經(jīng)其他氨基肽酶參與TA引導(dǎo)表位肽的處理。因此TA技術(shù)在研發(fā)CTL疫苗，不僅在直接體內(nèi)免疫還是體外致敏DC的細(xì)胞疫苗都有著廣闊的運(yùn)用前景。   本研究對(duì)表達(dá)的八聚體、四聚體、二聚體激發(fā)CTL免疫應(yīng)答水平進(jìn)行初步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)八聚體能有效刺激PBMC產(chǎn)生細(xì)胞增殖反應(yīng)，可明顯增強(qiáng)CTL免疫應(yīng)答水平，為隱球菌疫苗的研發(fā)和設(shè)計(jì)打下了基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】  1 Segal B H, Steinbach W J. Combination antifungals:

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