諾沃克病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒

1、 諾沃克病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)（第一版）適用于各種食品類材料、衛(wèi)生監(jiān)督、疾病控制等來(lái)源的臨檢樣品2006.12深圳易瑞生物技術(shù)有限公司試劑盒組成產(chǎn)品目錄號(hào)規(guī)格48次檢測(cè)諾沃克病毒RT-PCR一步法反應(yīng)液1080µl / 1管逆轉(zhuǎn)錄酶（5U/µl）24µl / 1管Taq酶（5U/µl）20µl / 1管諾沃克病毒G、G型陽(yáng)性對(duì)照100µl / 1管諾沃克病毒陰性對(duì)照100µl / 1管操作手冊(cè)1份注：本試劑盒不包括諾沃克病毒RNA提取試劑，用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒或試劑盒推薦的提取方法。產(chǎn)品介

2、紹² 本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，用于食品中的諾沃克病毒的檢測(cè)。符合SN/T1635-2005貝類中諾沃克病毒檢測(cè)方法 普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。² 檢測(cè)靈敏度：可達(dá)100拷貝/ml，定量檢測(cè)線性范圍可達(dá)10-1010拷貝/ml。² 特異性：本試劑盒根據(jù)最新基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)，并通過(guò)系統(tǒng)驗(yàn)證，能夠檢測(cè)所有已知G、G型諾沃克病毒。對(duì)于其它感染因子，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陰性。貯存與運(yùn)輸條件² 本試劑盒必須在-20下避光保存，有效期為6個(gè)月。² 需在低溫下運(yùn)輸。注意事項(xiàng)² 本試劑盒僅用于

3、體外檢測(cè)使用，操作人員必須經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并具有一定的經(jīng)驗(yàn)，試劑盒使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書全文。² 請(qǐng)嚴(yán)格按照基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作：如PCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格分區(qū)操作；各區(qū)應(yīng)有專用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人員應(yīng)遵循從一區(qū)到二區(qū)的單方向工作原則，各工作區(qū)相對(duì)隔離；進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的工作桌面和及相關(guān)物品應(yīng)定期用1%次氯酸鈉、75%酒精、1mol/L鹽酸或紫外燈進(jìn)行滅菌和消毒。² 所用的吸頭和離心管都需要經(jīng)DEPC水處理，以滅活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC處理過(guò)的水配制。² 試劑盒中各試劑充分融化后請(qǐng)短暫離心。反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上

4、機(jī)前應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免污染儀器。適用熒光PCR儀品牌與型號(hào)² Cepheid公司的SmartCycler² ABI公司的Prism7000、7700、7500、9600系列² Stratagene公司的MX3000、MX4000² Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000² Bio-Rad公司的iCycler系列、MJ opticon2² Roche公司的LightCycler等實(shí)驗(yàn)操作步驟² RNA提?。河脩艨刹捎猛ㄓ眯筒《綬NA提取試劑盒提取諾沃克病毒RNA用于檢測(cè)或保存于-20

5、（-80更佳）以待檢測(cè)。² 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)完成）Ø 從試劑盒中取出RT-PCR一步法反應(yīng)液，冰盒上融化后混勻，取出Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。試劑在使用前2000rpm離心20s。 Ø 設(shè)需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N = 待檢樣本數(shù)X份 + 1管陰性對(duì)照 +1管陽(yáng)性對(duì)照）。Ø MIX的配制：首先吸取反應(yīng)混合液至1.5ml滅菌離心管，體積22.1×N (µl)，再加入Taq DNA聚合酶0.4×N (µl)和逆轉(zhuǎn)錄酶0.5×N (µl)到1.5ml滅菌離心管，混勻后短暫離心（2000r

6、pm/20s），然后向N 個(gè)0.2ml PCR反應(yīng)管中分裝已加入Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的MIX各23µl/每管，蓋緊管蓋。每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制為：PCR反應(yīng)液22.1µl+0.4µl Taq酶+0.5µl逆轉(zhuǎn)錄酶。 Ø 注意：陰性對(duì)照管建議在此區(qū)中加入2µl陰性對(duì)照樣品。² 加樣（在樣品制備區(qū)完成）Ø 陽(yáng)性對(duì)照取出解凍，使用前2000rpm 離心20s。Ø 若樣本提取物保存在-20，則在使用前置室溫解凍；向N個(gè)PCR管中分別加入待檢樣本RNA（包括陽(yáng)性對(duì)照）2µl，蓋緊管蓋，2000rpm離心20s

7、，將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至核酸擴(kuò)增區(qū)。注意做好樣品號(hào)標(biāo)記。² PCR擴(kuò)增（在核酸擴(kuò)增區(qū)完成）Ø 上機(jī)前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。Ø 反應(yīng)體系設(shè)為25µl；熒光信號(hào)采集設(shè)定在退火溫度。對(duì)于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號(hào)采集通道。Ø PCR循環(huán)參數(shù)為：第一階段，50 30 min反轉(zhuǎn)錄第二階段，95 3min 預(yù)變性第三階段，95 10s；60 40s × 40次循環(huán)² 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果判斷Ø 陰性對(duì)照CT值應(yīng)顯示為0或40.0，陽(yáng)性對(duì)照的CT值應(yīng)30.0，否則視實(shí)驗(yàn)失敗，需重做。Ø 檢測(cè)樣品CT35.0，結(jié)果有效，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性；Ø 檢測(cè)樣品35.0<CT>40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若CT仍介于35.0和40.0之間，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)特性，同時(shí)陰性對(duì)照Ct值為零，可報(bào)告樣品陽(yáng)性，否則報(bào)告樣品陰性。Ø 檢測(cè)樣品CT值為零，報(bào)告樣本陰性。 ² 部分儀器閾值設(shè)定方法Ø 對(duì)于MJ Opticon2系列熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，扣除本底后再輸入循環(huán)1-15之間的熒光值，進(jìn)行CT值的設(shè)置或