L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝ppt課件

1、劉培培劉培培2021251341820212513418L-天冬酰胺酶的消費工藝天冬酰胺酶的消費工藝LOGO一天冬酰胺酶的化學組成和性質一天冬酰胺酶的化學組成和性質 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大腸桿菌菌體中提取分別的酶類藥物，用于治療白血病。1922年Clementi發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中有抑癌作用的物質，其活性成分是蛋白質；1961年Broome確定了其有效成分是天冬酰胺酶，后來，Mashburn等報告指出從大腸桿菌中分別出天冬酰胺酶，具有同樣抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末狀，微有濕性，溶于水，不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20儲存7d，

2、5儲存14d均不減少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30，60 1h內失活，最適PH8.5，最適溫度37。 二國內天冬酰胺酶的開展歷程二國內天冬酰胺酶的開展歷程 目前,國內臨床上運用的L2ASP 主要來源于大腸桿菌,我國天津生化廠于1974 年開場消費E1coli天冬酰胺酶,但由于菌種產(chǎn)酶才干低,提取精制工藝落后,難以與國外產(chǎn)品競爭,再加之其他緣由最后停產(chǎn)。為了填補國內空白,1995 年,中國藥科大學吳梧桐教授等率先進展了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表達研討,并初次在國內勝利構建了高效表達L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌發(fā)酵單位比野生株高出

3、100 倍。隨后又優(yōu)化了基因工程菌的培育條件和發(fā)酵工藝,確定了重組L2ASP 的純化道路,并對重組產(chǎn)品進展了鑒定。結果闡明,基因工程菌消費的產(chǎn)質量量與天然品從基因序列、蛋白質一級構造到蛋白質的物理化學性質等方面均一致,兩者具有同質性 。這些研討成果為我國工業(yè)化消費優(yōu)質、低價的注射用E1coliL2ASP 開辟了新的道路。 三抗腫瘤機制 L2ASP 抗腫瘤的作用機制在于它可以降低人抗腫瘤的作用機制在于它可以降低人 體內體內L2天冬酰胺天冬酰胺和和L2谷氨酰胺的濃度谷氨酰胺的濃度,這兩種氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶這兩種氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成不能合成L2天冬天冬酰胺酰胺,需酸是合成嘌呤環(huán)和

4、嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細要攝取外源需酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細要攝取外源L2天冬酰胺才干存活。當外源天冬酰胺才干存活。當外源L2天冬酰胺被分解掉時天冬酰胺被分解掉時,癌細胞合成核苷酸和癌細胞合成核苷酸和蛋白質的才干就會顯著降低蛋白質的才干就會顯著降低,因此因此L2ASP 能有效抑制腫瘤細胞的增殖。有能有效抑制腫瘤細胞的增殖。有研討闡明研討闡明, L2ASP 可以選擇性抑制體內可以選擇性抑制體內Ra2pamycin2靶標信號傳導通路靶標信號傳導通路,從而抑制腫瘤的增值從而抑制腫瘤的增值 。另有文獻報道。另有文獻報道,L2ASP 在體內發(fā)揚作用時能夠是經(jīng)在體內發(fā)揚作用時能夠是

5、經(jīng)過一種功能性的過一種功能性的p53 蛋白因子來介導腫瘤細胞的凋亡蛋白因子來介導腫瘤細胞的凋亡 。四工藝流程 大腸桿菌產(chǎn)生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于細胞質中,與底物L2天冬酰胺的親和力很小(Km = 1 10 - 3 mol/ L) ,沒有抗腫瘤活性;而L2ASP 那么分泌在細胞周質中,與L2天冬酰胺有很高的親和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 。現(xiàn)今,產(chǎn)生L2ASP 的菌種主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1

6、、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提純方法包括硫酸銨分級沉淀、乙醇分級沉淀、離子交換層析法、超濾、水系二相膠束系統(tǒng)、分批式吸附和直行式解吸附法、浸透休克法以及親和層析法等816 。采用不同方法最終得到目的產(chǎn)物的酶活力范圍為220520217 U/ mg ,總回收率為31 %86 %。天冬酰胺酶工藝流程圖天冬酰胺酶工藝流程圖 大腸桿菌大腸桿菌 肉湯菌種肉湯菌種 種子種子菌種菌種 發(fā)酵液發(fā)酵液 菌體菌體 提提取液取液 上清液上清液 沉淀沉淀 洗脫液洗脫液 洗脫液洗脫液 凍干凍干 L-天冬酰天冬酰胺酶胺酶菌種培育肉湯培育基37 48h玉米漿培育基37 4-8h種子培育發(fā)

7、酵玉米漿培育基37 6-8h離心提取蔗糖抽提液PH7.5 30 分級沉淀NH4)2SO455飽和度PH7.0分級沉淀NH4)2SO490飽和度離子沉淀DEAE-纖維素(DE52)離子交換CM-纖維素(CM52)工藝過程及要點工藝過程及要點1 菌種培育菌種培育采用大腸桿菌采用大腸桿菌Escherichia coli A.S.1.357,培育基加牛培育基加牛肉汁肉汁100mL,蛋白胨蛋白胨1g,氯化鈉氯化鈉0.5g,瓊脂瓊脂2-2.5g 37,在在試管中培育試管中培育24h，茄形瓶培育，茄形瓶培育8h，錐形瓶培育，錐形瓶培育16h。2 種子培育種子培育培育基用玉米漿培育基用玉米漿30kg，加水至，

8、加水至300kg，接種量，接種量1%-1。5%，37，通氣攪拌培育，通氣攪拌培育4-8h.一、總述一、總述3 發(fā)酵罐培育發(fā)酵罐培育取玉米漿取玉米漿100Kg，接種量，接種量8%，37，通氣攪拌培，通氣攪拌培育育6-8h，離心分別發(fā)酵液，得菌體加，離心分別發(fā)酵液，得菌體加2倍量丙酮倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風干成菌體干粉。攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風干成菌體干粉。4 蔗糖溶液抽提蔗糖溶液抽提將菌體細胞中參與將菌體細胞中參與5倍體積的蔗糖溶液蔗糖倍體積的蔗糖溶液蔗糖40%溶菌酶溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振振蕩蕩2h,8000r/min離心，收取上層酶

9、液。離心，收取上層酶液。5 硫酸銨分級沉淀取上述酶液，參與NH4)2SO4至55%飽和度，調PH至7.0，室溫攪拌1h，離心除去沉淀，取上清液參與NH4)2SO4到90%飽和度，離心搜集沉淀。6 純化將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析，透析后的酶液，經(jīng)過預先用10mmol/L，PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱1cm30cm,用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫，流速為40mL/h,搜集天冬酰胺酶活性組分，再調整PH4.8,經(jīng)過預先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱1cm8cm,用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫，搜集

10、酶活性組分，冷凍枯燥，即得L-天冬酰胺酶凍干粉，總收率為31%，比活為220U/mg蛋白。二、工藝流程圖二、工藝流程圖v 1 1絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程冷凍管冷凍管2525C C，孢子培育，孢子培育，7 7天天斜面母瓶斜面母瓶2525C C，孢子培育，孢子培育，7 7天天大米孢子大米孢子2626C C，種子培育，種子培育56h56h一級種子培育液一級種子培育液2727C C，種子培育，種子培育，24h24h二級種二級種子培育液子培育液27262726C,C,發(fā)酵發(fā)酵,7,7天天發(fā)酵液。發(fā)酵液。2 2球狀菌二級發(fā)酵工藝流程球狀菌二級發(fā)酵工藝流程冷凍管冷凍管2525C C，孢子

11、培育，孢子培育，6868天天親米親米2525C C，孢，孢子培育，子培育，810810天天消費米消費米2828C C，孢子培育，孢子培育，5660h5660h種子培育液種子培育液2625-242625-24C C，發(fā)酵，發(fā)酵，7 7天天發(fā)酵液。發(fā)酵液。三、青霉素發(fā)酵過程三、青霉素發(fā)酵過程v 青霉素發(fā)酵時，青霉素消費菌在適宜的培育基、青霉素發(fā)酵時，青霉素消費菌在適宜的培育基、PHPH、溫度和通、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進展生長并合成青霉素。氣攪拌等發(fā)酵條件下進展生長并合成青霉素。v 發(fā)酵開場前，有關設備和培育基主要是碳源、氮源、前體和發(fā)酵開場前，有關設備和培育基主要是碳源、氮源、前體和無機鹽等

12、必需先經(jīng)過滅菌，后接入種子。無機鹽等必需先經(jīng)過滅菌，后接入種子。v 在整個過程中，需求不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫暖罐壓，在整個過程中，需求不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫暖罐壓，在發(fā)酵過程中往往要參與泡沫劑，假設酸堿控制發(fā)酵液的在發(fā)酵過程中往往要參與泡沫劑，假設酸堿控制發(fā)酵液的PHPH，還需求間歇或延續(xù)的參與葡萄糖及銨鹽等化合物以補充碳源及還需求間歇或延續(xù)的參與葡萄糖及銨鹽等化合物以補充碳源及氮源，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的消費。氮源，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的消費。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個階段。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個階段。v菌體生長階段：發(fā)酵培育基接種后消費菌在適宜的環(huán)境菌體生長階段：發(fā)酵培育基接種后消費菌在適宜的環(huán)境中經(jīng)過短時間的順應，即開場發(fā)育、生長和繁衍，直至中經(jīng)過短時間的順應，即開場發(fā)育、生長和繁衍，直至到達菌體的臨界濃度。到達菌體的臨界濃度。 v青霉素合成階段：這個階段主要合成青霉素，青霉素的青霉素合成階段：這個階段主要合成青霉素，青霉素的消費速率到達最大，并不斷維持到青霉素合成才干