westernblot原理試劑配制操作步驟

1、Western Blot原理、試劑配制、操作步驟western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作 為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的 抗體檢測(cè)。本文主要通過以下幾個(gè)方面來(lái)詳細(xì)地介紹一下Western blot技術(shù)：一、原理二、分類i.放射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECLiii.底物熒光 ECF iv,底物DAB呈色三、主要試劑四、主要步驟五、實(shí)驗(yàn)常見的問題指南1,參考書推薦2.針對(duì)樣品的常見問題3,抗體4,濾紙、膠和膜的問題5.marker的相關(guān)疑問6.染色的選擇7.參照的疑問8.緩沖液配方的常見問題9

2、.條件的摸索10.方法的介紹11.結(jié)果分析一、 原理與Southern或Northern雜交方法類似，但 Western Blot采用 的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以 非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及 其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗 原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二 抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的 特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè) 蛋白水平的表達(dá)。二、分類現(xiàn)常用的有

3、底物化學(xué)發(fā)光 ECL和底物DAB呈色，體同水平 和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物 化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行， 操作也比較簡(jiǎn)單， 原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾, 如遇到HRP,即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗由條帶。三、主要試劑1、丙烯酰胺和N, N'-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于 溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N , N'-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g, N,N-亞甲叉雙丙稀酰胺 1g,加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶， 4c避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0

4、,因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾 個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、 十二烷基硫酸鈉 SDS 溶液：10%(w/v)0.1gSDS , 1mlH2O 去離子水配制，室溫保存。3、 分離膠緩沖液：1.5mmol/L Tris-HCl (pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/L HCl混合，加水稀釋到 100ml終體積。過濾后 40c保存。4、濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl (pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O中，用約 48ml 1mol/L HCl調(diào)至pH6.8加水稀釋到 100ml終體積。過濾

5、后40C保存。這兩種緩沖液必須使用 Tris 堿制備，再用 HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用 Tris.CL。5、TEMED原溶液N, N, N' N'四甲基乙二胺催化過硫酸鏤形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀 酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù) ml,臨用前配制.6、SDS- PAGE 加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris 緩沖液 8ml, 甘油 6.4ml, 10%SDS 12.8ml,航基乙醇 3.2ml, 0.05%澳酚藍(lán) 1.6ml, H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋

6、白質(zhì)樣品 混合，在沸水終點(diǎn) 3min混勻后再上樣，一般為 20-25ul,總 蛋白量100以g。7、Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris , 188g甘氨酸，10gSDS, 用蒸儲(chǔ)水溶解至 1000ml,得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸 電極緩沖液。臨用前稀釋 10倍。8、轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、 5.8gTris堿、0.37g SDS,并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅 S 2g三氯乙酸30g磺基水 楊酸30g加水至100ml用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春 紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。10、脫

7、脂奶粉5%(w/v)11、 NaN3 0.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩 沖鹽溶液(PBS) o12、Tris 緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCl(pH7.5), 500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、 BCIP(溶于 100% 二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、 100mmol/LTris-HCl(pH9.5)。18、100mmol/L NaCl。19、50mmol/LTris-HCl(pH7.

8、5) , 5mmol/L EDTA。(可以參看分子克隆）四、主要步驟搜集了現(xiàn)階段幾乎網(wǎng)上所有的Western Blot的中英文資料，僅供實(shí)驗(yàn)參考，可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：Western Blot PROTOCOL;五、實(shí)驗(yàn)常見的問題指南根據(jù)問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權(quán)作參考，請(qǐng)勿盲目模仿!）；1,參考書推薦A.對(duì)初學(xué)者看什么資料比較好？解答：抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南和 Antibodies（a laboratory manual , wrote by Ed Harlow , david lane）兩本書不錯(cuò)。2,針對(duì)樣品的常見問題B.做線粒體膜 UCP2蛋白的 Western B

9、lot （以下簡(jiǎn)寫成Western Blot）,提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的 博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已 加到120以g,換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因 ？ 蛋白酶抑制劑單加 PMSF行嗎？解答：懷疑是樣品問題，可能是： 1,樣品不能反復(fù)凍融；2, 樣品未加蛋白酶抑制劑。 同時(shí)，建議檢查 Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說，一般加 PMSF就 可以了，最好能多加幾甲種蛋白酶抑制劑。C.同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？解答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。D.如果

10、目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什 么？解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得 多，這時(shí)最好加上 NaF去抑制磷酸化酶的活性。E我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn) 膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后 染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有 什么辦法可以解決？解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用 減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，多加 5-10%甲醇。F.想分離的蛋白是分子量 260kd的，SDS-PAGE電泳的分離 膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少 ？這么大分子量的 蛋白容易作 Western Blot嗎？解答：26

11、0kd的蛋白不好做，分離膠用6%, Stacking Gel3.5% oG如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來(lái)弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30%是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的 厚度，可以試試 1.5mm的comboH.蛋白變性后可以存放多久？解答：-80C, 一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶 水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。I.我所測(cè)定的蛋白分子量是 105KD ,按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用 7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方，不知為何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。J.接下來(lái)我準(zhǔn)備采用 DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多 克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案 后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5%的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀肂SA 代替應(yīng)該好一點(diǎn).K.還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？解答：Western Blot 一般上樣