木聚糖酶和CMC活力的測定方法

1、木聚糖酶活力的測定方法1. 方法：3，5二硝基水楊酸比色法，簡稱DNS法。2. 原理：還原糖能將3，5二硝基水楊酸分子中的硝基還原成橙黃色的3胺基5硝基水楊酸。溶液橙黃色強度與還原糖量成正比。3. 主要儀器和設(shè)備天平（感量1mg和0.1mg兩種），離心機，恒溫水浴鍋，磁力攪拌器,分光光度計（722型，符合GB9721的有關(guān)規(guī)定）。4. 試劑和溶液4.1 所用水除特別要求外,均為符合GB/66821992規(guī)定的三級水, 化學藥品除特別要求外,均為分析純。4.2 DNS試劑稱取3，5二硝基水楊酸10g加入500 ml水中，分多次加入氫氧化鈉16g，攪拌溶解(溫度45)，再分多次加入酒石酸鉀鈉300

2、g，攪拌至全溶，冷卻后用水定容至1000ml。室溫下棕色瓶儲存暗處放置，一周后使用(如有沉淀過濾后使用)。4.3 0.1mol/L，pH5.0醋酸醋酸鈉緩沖液吸取冰醋酸1.8ml,加適量水，加醋酸鈉5.78g，溶解, 定容至1000ml,調(diào)節(jié)PH至5.00±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。4.4 0.1%即1mg/ml木糖標準溶液 無水木糖于80烘至恒重，稱取0.1000g于燒杯中,加適量水溶解,轉(zhuǎn)入容量瓶中并定容至100ml。4.5 1.0%木聚糖溶液 稱取木聚糖1.00g于燒杯中，用2ml 0.5mol/L氫氧化鈉潤濕成糊狀，加40ml緩沖液，于6070水浴中加熱溶解，冷涼

3、后用0.5mol/L醋酸（約2ml）調(diào)pH5.0，轉(zhuǎn)入容量瓶中,加緩沖液(4.3)定容至100ml。如果冰箱中放置時間長了出現(xiàn)沉淀，使用前應(yīng)在熱水浴中熱溶。4.6 木糖標準曲線的繪制吸取1mg/ml木糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于試管中，補水至2ml，加DNS試劑3ml，混合后于沸水中煮10min,冷卻后定容至15ml,于分光光度計540nm波長下測吸光度（A）。以吸光度為縱坐標，木糖量為橫坐標,繪制標準曲線,三次重復(fù)試驗的均值用最小二乘法擬合一元線性方程yaxb,求出吸光度與木糖量的關(guān)系。5. 待測酶樣品的處理5.1 液體酶:直接吸取酶液做適當稀釋，使測定光吸收值在0

4、.250.4范圍內(nèi)。5.2 液體曲：離心上清液做適當稀釋，使測定光吸收值在0.250.4范圍內(nèi)。5.3 固體曲：按干重計稱取4g于三角瓶中，加水200ml，室溫下磁力攪拌浸提0.5h。取離心上清液做適當稀釋。5.4 固體粉狀酶：稱取適量于燒杯中(精確至0.0001g)，用少量水潤濕并調(diào)成糊狀，再用水溶解，離心上清液做適當稀釋。5.5 固體粒狀酶：研磨成粉后如5.3處理。6. 酶活力測定取15 ml具塞刻度試管按下面的反應(yīng)順序進行操作,在反應(yīng)過程中,從加入底物(吸取前搖勻) (4.5)開始,向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致, 50水解10 min.反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見下表:試樣空白

5、1.加底物(4.5)1.8ml1.加底物(4.5)1.8ml2.50預(yù)熱3min2.50預(yù)熱3min3.加酶液0.2ml3. 50水解10 min4.混合4. 加DNS試劑3 ml5.50水解10 min5. 混合6.加DNS試劑3 ml6. 加酶液0.2 ml7.混合7.混合8.沸水浴中10 min8.沸水浴中10 min9.冷卻定容至15 ml9.冷卻定容至15 ml10.空白調(diào)零540nm下測定10.空白調(diào)零540nm下測定7. 酶活力單位計算酶活力(S×D×1000)/（0.2×10）×1.7 µg/ml(g).min式中： S測得光吸

6、收在標準曲線上對應(yīng)的木糖量，mg數(shù)；D酶液或酶粉稀釋倍數(shù)；1000 mg和µg之間的換算系數(shù)；0.2測定所取酶液量，ml數(shù)；10反應(yīng)時間，min數(shù)；1.7方法換算系數(shù)。8. 酶活力單位定義及換算8.1 本方法酶活定義:在本測定條件下，每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1µg還原糖（以木糖計）所需酶量定義為一個酶活力單位（u）。國際酶活單位的定義:在測定條件下,每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1µmol還原糖（以木糖計）所需酶量定義為一個酶活力單位（IU）。8.2 u與國際單位IU 的換算關(guān)系： 1 u1÷150 IU（µmol糖/ml(g).min）150: 木糖的分子

7、量內(nèi)切纖維素酶(CMC酶)活力的測定方法1. 方法：3，5二硝基水楊酸比色法，簡稱DNS法。2. 原理：還原糖能將3，5二硝基水楊酸分子中的硝基還原成橙黃色的3，5硝基水楊酸。溶液橙黃色強度與還原糖量成正比。3. 主要儀器和設(shè)備天平（感量1mg和0.1mg兩種），離心機，恒溫水浴鍋，磁力攪拌器,分光光度計（722型，符合GB9721的有關(guān)規(guī)定）。4. 試劑和溶液4.1 所用水除特別要求外,均為符合GB/66821992規(guī)定的三級水, 化學藥品除特別要求外,均為分析純。4.2 DNS試劑 稱取3，5二硝基水楊酸10g加入500 ml水中，分多次加入氫氧化鈉16g，攪拌溶解(溫度45)，再分多次加

8、入酒石酸鉀鈉300g，攪拌至全溶，冷卻后用水定容至1000ml。室溫下棕色瓶儲存暗處放置，一周后使用(如有沉淀過濾后使用)。3.3 0.1mol/L，pH4.80醋酸醋酸鈉緩沖液 吸取冰醋酸2.4ml,加適量水，加醋酸鈉4.92g，溶解, 定容至1000ml ,調(diào)節(jié)PH至4.80±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。3.4 0.1%即1mg/ml葡萄糖標準溶液 無水葡萄糖于80烘至恒重，稱取0.1000g于燒杯中,加適量水溶解,轉(zhuǎn)入容量瓶中并定容至100ml。3.5 1.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液 稱取CMC-Na 1.50g于燒杯中,加適量緩沖液置于水浴中加熱(50)

9、溶解成膠狀，轉(zhuǎn)入容量瓶中并用緩沖液(4.3)定容至100ml,置冰箱中備用。3.6 葡萄糖標準曲線的繪制吸取1mg/ml無水葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于試管中，補水至2ml，加DNS試劑3ml，混合后于沸水中煮10min,冷卻后定容至15ml,于分光光度計540nm波長下測吸光度（A）。以吸光度為縱坐標，葡萄糖量為橫坐標,繪制標準曲線,三次重復(fù)試驗的均值用最小二乘法擬合一元線性方程yaxb,求出吸光度與葡萄糖量的關(guān)系。4 待測酶樣品的處理5.1 液體酶:直接吸取酶液做適當稀釋，使測定光吸收值在0.250.4范圍內(nèi)。5.2 液體曲：離心上清液做適當稀釋，使測定光吸收

10、值在0.250.4范圍內(nèi)。5.3 固體曲：按干重計稱取4g于三角瓶中，加水200ml，室溫下磁力攪拌浸提0.5h。取離心上清液做適當稀釋。5.4 固體粉狀酶：稱取適量于燒杯中（精確至0.0001 g），用少量水潤濕并調(diào)成糊狀，再用水溶解，離心上清液做適當稀釋。5.5 固體粒狀酶：研磨成粉后如5.3處理。6 酶活力測定取15 ml具塞刻度試管按下面的反應(yīng)順序進行操作,在反應(yīng)過程中,從加入底物(吸取前搖勻)(4.5)開始,向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致, 50水解30 min.反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見下表:試樣空白1.加底物(4.5)1.8ml1.加底物(4.5)1.8ml2.50預(yù)熱

11、3min2.50預(yù)熱3min3.加酶液0.2ml3. 50水解30 min4.混合4. 加DNS試劑3 ml5.50水解30 min5. 混合6.加DNS試劑3 ml6. 加酶液0.2 ml7.混合7.混合8.沸水浴中10 min8.沸水浴中10 min9.冷卻定容至15 ml9.冷卻定容至15 ml10.空白調(diào)零540nm下測定10.空白調(diào)零540nm下測定7 酶活力單位計算酶活力(S×D×1000)/（0.2×30）÷1.5 µg/ml(g).min式中： S測得光吸收在標準曲線上對應(yīng)的葡萄糖量，mg數(shù)；D酶液或酶粉稀釋倍數(shù)；1000mg和µg之間的換算系數(shù)；0.2測定所取酶液量，ml數(shù)；30反應(yīng)時間，min數(shù)；1.5方法換算系數(shù)。8 酶活力單位定義及換算8.1 本方法酶活定義:在本測定條件下，每分鐘水解CMC