基因敲除細(xì)胞系：設(shè)計(jì)gRNA高效KO-以及避免蛋白殘留

1、基因敲除細(xì)胞系：如何設(shè)計(jì)gRNA高效KO，以及避免蛋白殘留 源井生物基因組編輯是一種理想的研究基因功能的方法。它可以精確地識別和定位基因組中的特定序列，然后改變目標(biāo)序列以達(dá)到各種目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于其簡單的機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)今世界基因組編輯的代名詞。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常見的應(yīng)用。在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除實(shí)驗(yàn)中，Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSB）。由于DSB的不完全修復(fù)而產(chǎn)生插入和缺失（indels），引起移碼突變，導(dǎo)致終止密碼子提前，實(shí)現(xiàn)編碼基因敲除的目的。在CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)中，g

2、RNA的選擇將很大程度上影響項(xiàng)目的成功率。在選擇gRNA的時(shí)候，有幾個(gè)因素可以幫助大家選取有效的gRNA以產(chǎn)生成功的敲除：1）預(yù)測gRNA效率；2）選擇脫靶風(fēng)險(xiǎn)低的gRNA；3）同時(shí)使用多個(gè)gRNA以提高敲除效率。在編碼基因敲除實(shí)驗(yàn)中， DNA水平驗(yàn)證KO結(jié)果是首要的，此外，蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證也非常關(guān)鍵。蛋白水平的驗(yàn)證通常是通過Western Blot實(shí)現(xiàn)的，但以下這兩種現(xiàn)象，有可能導(dǎo)致截短蛋白仍然表達(dá)，從而致使WB驗(yàn)證時(shí)出現(xiàn)陽性情況。(1) 基因產(chǎn)生移碼突變后，下游ATG密碼子有可能啟動(dòng)翻譯，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)。或者位于移碼突變上游的外顯子翻譯表達(dá)，產(chǎn)生N末端截短蛋白。(2) 

3、;細(xì)胞跳過被編輯的外顯子翻譯表達(dá)，產(chǎn)生內(nèi)部序列缺失的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。圖1: 抗INDEL效應(yīng)導(dǎo)致CRISPR基因敲除實(shí)驗(yàn)失敗的細(xì)胞機(jī)制翻譯重新啟動(dòng)CRISPR介導(dǎo)的基因敲除通常是通過Cas9產(chǎn)生dsDNA斷裂來實(shí)現(xiàn)的：在切割之后，非同源末端連接（NHEJ）的易出錯(cuò)性質(zhì)會導(dǎo)致在切割位點(diǎn)有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入或缺失（indels），從而引起移碼突變，終止密碼子提前，并產(chǎn)生無義介導(dǎo)的降解(NMD)， 從而完全敲除基因。因此打靶位點(diǎn)常常選擇盡量靠近開放閱讀框（ORFs）5端。然而，這個(gè)策略往往會忽略O(shè)RF內(nèi)的存在ATG啟動(dòng)另一個(gè)ORF并翻譯成截短型蛋白的可能。已經(jīng)有不少文章報(bào)道過這種非法翻譯（ITL）

4、蛋白，它是與人類疾病相關(guān)的遺傳因素。因此，基因編輯介導(dǎo)的閱讀框外的突變可能會導(dǎo)致非法翻譯，從而表達(dá)可被抗體識別的截短型蛋白質(zhì)。圖2: 翻譯重新啟動(dòng)的機(jī)制外顯子跳躍最近，Mu等人報(bào)道，利用CRISPR和單個(gè)sgRNA，在細(xì)胞系中打靶外顯子，可以通過以下兩種機(jī)制產(chǎn)生外顯子跳躍：第一種是在突變的前體mRNA剪接過程中發(fā)生的；第二種是由于基因缺失導(dǎo)致多個(gè)外顯子和其余外顯子剪接。已知跳躍多個(gè)外顯子的機(jī)制是：基因缺失后，完整的外顯子被剪接。更復(fù)雜和令人關(guān)注的是，只有一到幾個(gè)核苷酸的突變才會導(dǎo)致前體mRNA剪接過程中外顯子跳躍。除了內(nèi)含子-外顯子邊界的剪接位點(diǎn)外，外顯子還包含對剪接效率起積極或消極作用的序列

5、。外顯子內(nèi)起正作用的元件，稱為外顯子剪接增強(qiáng)子（ESEs），與識別增強(qiáng)剪接機(jī)制的因子結(jié)合。起負(fù)作用的元件稱為剪接沉默子（ESSs），它被認(rèn)為是抑制廢置剪接位點(diǎn)的使用。因此，我們可以假設(shè)indel通過破壞ESE或偶然引入ESS來促進(jìn)外顯子跳躍。這些機(jī)制將造成被打靶外顯子缺失的截短型ORF的表達(dá)，從而干擾WB驗(yàn)證結(jié)果及后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。圖3: 外顯子跳躍的機(jī)制那我們該怎么做？對KO實(shí)驗(yàn)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制是十分重要的，以確保構(gòu)建的基因敲除細(xì)胞不包含隱藏的“驚喜”。理想情況下，我們可以事先預(yù)測如何打靶一個(gè)基因來避免外顯子跳過的問題。在設(shè)計(jì)KO項(xiàng)目之前，可以做以下實(shí)驗(yàn)，以幫助制定避免上述蛋白殘留的問題的打靶

6、策略。1. 具有跳躍能力，如果有，則測定蛋白質(zhì)編碼潛能。例如，分別設(shè)計(jì)引物，識別位于潛在跳躍外顯子上下游的外顯子，以及目的外顯子，通過比較RT-qPCR結(jié)果，我們將能夠判斷是否發(fā)生了外顯子跳躍，以及它是否會影響基因敲除結(jié)果。2. 翻譯形式檢測。在抗體特異性很高的前提下，WB結(jié)果中如果出現(xiàn)預(yù)期的條帶，以及在不同分子量（MW）處有其它雜帶，這表明這個(gè)基因存在蛋白質(zhì)異構(gòu)體。根據(jù)大小，并結(jié)合上述RT-PCR結(jié)果，可初步判斷編碼異構(gòu)體的ORF。結(jié)合質(zhì)譜分析則可以進(jìn)一步確認(rèn)異構(gòu)體的存在及來源ORF的構(gòu)成。如何設(shè)計(jì)有把握的gRNA？在設(shè)計(jì)gRNA時(shí)，除了常規(guī)的參數(shù)（靶向效率和脫靶效應(yīng)），

7、應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)庫、文獻(xiàn)、上述qPCR、WB等檢測結(jié)果來判斷靶基因的潛在的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本、ORF、起始密碼子位置、外顯子大小和是否不對稱外顯子，來選擇要打靶的位點(diǎn)或區(qū)域。比如，如果存在截短型ORF及非法翻譯，則大靶位點(diǎn)應(yīng)該保證同時(shí)會破壞這些ORF；如果存在外顯子跳躍，則應(yīng)該避開靶向被條約的外顯子；如果因?yàn)榇嬖诙鄠€(gè)ORF、外顯子跳躍而無法設(shè)計(jì)有效的移碼策略，則應(yīng)該考慮采用大片段敲除或直接破壞啟動(dòng)子等策略進(jìn)行敲除?？傊?，CRISPR技術(shù)的正確使用始終取決于仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、執(zhí)行和分析。為一個(gè)實(shí)驗(yàn)選擇gRNA需要平衡最大化打靶效率和最小化脫靶效應(yīng)，同時(shí)想獲得無蛋白殘留的KO細(xì)胞，則必須在gRNA設(shè)計(jì)階段綜合考慮

8、各種因素，確認(rèn)最優(yōu)方案。源井生物專注基因編輯細(xì)胞技術(shù)服務(wù)，擁有自主研發(fā)的gRNA設(shè)計(jì)系統(tǒng) “紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)”，此外專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)幫助科研工作者設(shè)計(jì)完備的基因敲除解決方案。我們已幫助科研一線工作者在100多種細(xì)胞系上進(jìn)行基因編輯。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)積累和數(shù)據(jù)分析，現(xiàn)推出5000個(gè)保證WB驗(yàn)證無誤的基因敲除服務(wù)。Reference:Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knockouts. Nature methods (2019), 16(11):1087-1093.Low Incidence of Off-Targe

9、t Mutations in Individual CRISPR-Cas9 and TALEN Targeted Human Stem Cell Clones Detected by Whole-Genome Sequencing. Cell Stem Cell (2014),15:2730.Agreement between two large pan-cancer CRISPR-Cas9 gene dependency data sets. Nat Commun (2019), 10(1):5817.Unexpected consequences: exon skipping caused by