利用熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞建立活體成像動物模型_圖文

1、中國體視學(xué)與圖像分析2013年第18卷第1期CHINESE JOURNAL OF STEREOLOGY AND IMAGE ANALYSIS Vol18No1March201367文章編號:10071482(20130100670072生物醫(yī)學(xué)利用熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞建立活體成像動物模型張繪宇1,鄭國兵2,張金棟2,劉啟才2(1.廣州醫(yī)學(xué)院病理教研室,廣州510182; 2.廣州醫(yī)學(xué)院實驗醫(yī)學(xué)研究中心,廣州510182摘要:目的建立穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的人乳腺癌細(xì)胞株并構(gòu)建適用于小動物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型。方法采用脂質(zhì)體將攜帶熒光素酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中,G

2、418篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的單克隆細(xì)胞株。擴(kuò)增后接種于裸鼠,建立裸鼠皮下移植瘤模型,通過活體動物成像系統(tǒng)監(jiān)測腫瘤的生長過程。結(jié)果獲得了高水平穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的乳腺癌單克隆細(xì)胞株,該單克隆細(xì)胞株與母細(xì)胞系MCF-7具有相似的生長特性。將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的克隆接種于裸鼠皮下可成瘤,小動物活體成像系統(tǒng)能準(zhǔn)確監(jiān)測腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長過程。結(jié)論成功建立了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的乳腺癌單克隆細(xì)胞株。采用活體動物成像系統(tǒng)構(gòu)建的裸鼠皮下移植瘤模型是拓展腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移及治療相關(guān)研究的理想模型。關(guān)鍵詞:熒光素酶;生物發(fā)光;移植瘤;活體成像;裸鼠中圖分類號:R73文獻(xiàn)標(biāo)識碼:AEstablishment of a

3、nude mouse model of in vivo bioluminescenceimaging generated by luciferase-labeled cancer cellsZHANG Huiyu1,ZHENG Guobin2,ZHANG Jindong2,LIU Qicai2(1.Department of Pathology,Guangzhou Medical College,Guangzhou510182,China;2.Experimental Medicine Research Center,Guangzhou Medical College,Guangzhou510

4、182,ChinaAbstract:Objective To establish a mouse model of in vivo bioluminescence imaging by subcutaneous inoculation of luciferase-labeled human breast cancer cells into nude miceMethods Recombinant plas-mid containing luciferase gene was transfected into human breast cancer cell line MCF-7cells,an

5、d a mon-oclonal cell line stably expressing luciferase was screened outThe cultured cells were subcutaneously in-oculated into nude mice to establish mouse models of transplanted tumors,and the tumor growth was moni-tored by in vivo animal imaging systemResults A monoclonal cell line stably and high

6、ly expressing lu-ciferase was obtainedThe cell line showed similar growth characteristics of the original human breast cancer cell line MCF-7cellsThe cell clone stably expressing luciferase was subcutaneously inoculated in-收稿日期:2013-01-14基金項目:廣東省自然科學(xué)基金(06301124作者簡介:張繪宇(1964,女(漢,河北廊坊人,副教授。研究方向:腫瘤病理及多

7、媒體教學(xué)。通信作者:劉啟才,副教授。E-mail:Liuqicai96868中國體視學(xué)與圖像分析2013年第18卷第1期to nude mice and subcutaneous tumors were formedThe in vivo tumor growth characteristics were closely monitored with small animal imaging systemConclusions A monoclonal cell line stably expressing lu-ciferase is successfully establishedThe

8、nude mouse models of subcutaneous transplanted tumor generated by inoculation of those luciferase-expresssing cells can be well monitored with in vivo animal imagine sys-tem,and provide ideal models for researches on tumor growth,metastasis,and treatmentKey words:luciferase;bioluminescence;transplan

9、table tumor;in vivo imaging;nude mice0引言乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,在我國許多大中型城市,乳腺癌已居女性惡性腫瘤死亡率的首位。乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最主要原因,淋巴結(jié)陰性的患者中約有24% 30%出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,淋巴結(jié)陽性的患者中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)50% 60%,而轉(zhuǎn)移性乳腺癌的5年生存率僅為26%1。尋找有效的藥物用于轉(zhuǎn)移性乳腺的治療是目前迫切需要解決的難題。螢火蟲熒光素酶(Luciferase是一種常用的信號分子,可以用來標(biāo)記腫瘤細(xì)胞24。使研究人員能夠通過活體成像系統(tǒng)直接觀察細(xì)胞在體內(nèi)的生長、轉(zhuǎn)移及對藥物的反應(yīng)等。特別是在腫瘤的研究中

10、,能夠無創(chuàng)傷定量對動物體內(nèi)的原位癌、轉(zhuǎn)移癌進(jìn)行直接快速檢測和測量5。本研究將帶有熒光素酶報告基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pRc/CMV2-luc轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,利用G418篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆(MCF-7-luc,并在體外評價其發(fā)光能力。通過建立裸鼠移植瘤模型,利用活體生物發(fā)光成像系統(tǒng)檢測腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況,為下一步監(jiān)測裸鼠移植瘤對藥物作用的變化情況,從而為分析藥物對腫瘤的治療效果提供理想的實驗動物檢測平臺67。1材料與方法11材料111試劑和儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、G418和Lipo-fectamine TM2000購自美國Invitrogen公司;

11、Luciferase Assay System和Luciferin(in vivo Grade購自美國Promega公司;細(xì)胞計數(shù)儀Z2coulter購自美國BECKMAN COULTER公司;熒光素酶檢測系統(tǒng)GLOMAX96micro plate luminometer購自Promega公司;活體成像系統(tǒng)Night OWLLB983NC100購自德國Berthold公司。112細(xì)胞和動物人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和重組質(zhì)粒pRc/ CMV2-luc由廣州醫(yī)學(xué)院實驗醫(yī)學(xué)研究中心提供8;4 5周齡BLAB/c nu/nu裸鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(SCXK(粵20080002。12方法121G

12、418最佳篩選濃度的確定MCF7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期MCF7細(xì)胞,按每孔1104個接種于12孔板中,置于5%CO2、飽和濕度、37細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。G418按0、200、400、600、800、1000g/ml設(shè)置6個濃度梯度。在細(xì)胞接種24h后,加入孔板中,每個濃度設(shè)置2個復(fù)孔。每天觀察細(xì)胞生長情況,在10 14d內(nèi)全部死亡的最低G418濃度,即為篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染克隆MCF 7細(xì)胞的濃度。122細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的MCF7細(xì)胞,將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,24h內(nèi)待細(xì)胞融合度達(dá)到80% 90%即可轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine TM2000試劑

13、盒操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在250l無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中加入8g/ml的pRc/CMV2-luc質(zhì)粒,在250l無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中加入10l Lipofectamine TM2000,室溫培育5min。將上述2種稀釋液混勻,室溫培育30min后加入細(xì)胞孔板2013年第18卷第1期張繪宇等:利用熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞建立活體成像動物模型69中,置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。123單克隆細(xì)胞篩選轉(zhuǎn)染24h后胰酶消化細(xì)胞并按16比例接種到新6孔板中,同時加入實驗確定的濃度G418,隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細(xì)胞抗性克隆的出現(xiàn)。分別挑選單一抗性克隆至96孔板,待其逐漸增

14、殖后轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。124熒光素酶活性鑒定陽性克隆單一抗性克隆傳代至第五代時用Luciferase As-say Aystem檢測熒光素酶活性。檢測時,各克隆按1105個/孔接種到24孔板,24h后細(xì)胞裂解液裂解,收集裂解物,12000rpm,4離心10min,取上清10l加入96孔白板中,向每孔加入50l熒光素酶底物,停留2s后,96microplate luminometer連續(xù)讀取10s的熒光值(RLU,每個克隆設(shè)3個復(fù)孔,保留RLU值高的細(xì)胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng),再過5代后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代,熒光素酶活性最高的幾個克隆MCF-7-luc

15、即為陽性克隆。125各不同數(shù)量細(xì)胞克隆的熒光值檢測將篩出的MCF-7-luc陽性克隆細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)4104、2104、1104、5000、2500、1250、625、312和156分別接種到96孔黑板中,另外一組僅有細(xì)胞,一組僅有培養(yǎng)基作對照,設(shè)置2個復(fù)孔,常規(guī)培養(yǎng)24h后,去上清并用PBS洗兩次,每孔加入100l PBS,再加入D-Luciferin使其終濃度為150g/ml,立即用活體成像系統(tǒng)檢測,分析發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。126細(xì)胞生長曲線繪制取表達(dá)熒光素酶的MCF-7-luc細(xì)胞和作為對照的MCF-7細(xì)胞,接種于24孔板,接種密度為2104/孔。細(xì)胞接種后1 7d,每天胰蛋白酶消

16、化其中3孔細(xì)胞,用細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)。以細(xì)胞生長天數(shù)為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo),分別繪制兩種細(xì)胞生長曲線。127BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/c nu/nu裸鼠,4 5周齡,體重(152g,雌雄各3只。取對數(shù)生長期的MCF-7-luc克隆細(xì)胞,用PBS重懸為25107/ml懸液,每只裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種100l,共接種6只。接種后第5d采用德國BERTHOLD公司的活體成像系統(tǒng)檢測信號強(qiáng)度。以后每5d觀測一次,連續(xù)觀測30d。觀測前每只裸鼠戊巴比妥鈉麻醉(計量為:35mg/kg體重,按150mg/kg體重的量腹腔注射luciferin(in vivo grade,10m

17、in 后,進(jìn)行活體成像觀察皮下腫瘤的生長情況,定量分析各時間點的熒光值。繪制腫瘤皮下生長曲線。128MCF-7-luc細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的病理形態(tài)學(xué)觀察MCF-7-luc細(xì)胞裸鼠皮下接種后25d,脫頸處死小鼠,取腫瘤組織,制成石蠟切片,切片厚度為3m,經(jīng)HE染色后觀察細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)。2結(jié)果21穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的MCF-7細(xì)胞系(MCF-7-luc的鑒定結(jié)果經(jīng)G418濃度梯度篩選,確定MCF-7細(xì)胞的最佳G418篩選濃度為800g/ml,pRc/CMV2-luc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7后經(jīng)800g/ml的G418篩選2周后出現(xiàn)單一抗性克隆,挑選48個單克隆至96孔板后繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并傳代,至第5代時

18、利用熒光素酶活性檢測,共篩選出11個RLU值較高的抗性克隆(圖1。通過熒光素酶活性檢測進(jìn)一步逐步淘汰,最后傳至30代時得到RLU最高的3個克隆clone26、clone27、clone29作為陽性克隆, RLU值依次為:34105、27105、13105,如圖2所示 。圖1MCF-7-luc的熒光素酶鑒定70中國體視學(xué)與圖像分析2013年第18卷第1期 圖2MCF-7-luc 的不同代數(shù)的熒光素酶值22體外培養(yǎng)各濃度梯度MCF-7-luc 活細(xì)胞的熒光值檢測結(jié)果采用倍比稀釋法測定9個濃度梯度細(xì)胞的熒光值?；铙w成像系統(tǒng)nightOWL indigo 軟件進(jìn)行圖像采集和數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示體外活體細(xì)

19、胞檢測最少細(xì)胞數(shù)為156個,而且隨著細(xì)胞的增加,光子數(shù)和細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)R 2=0986(圖3。 圖3體外培養(yǎng)各濃度梯度MCF-7-luc 活細(xì)胞的生物發(fā)光成像23穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的MCF-7細(xì)胞系的生長特性細(xì)胞計數(shù)觀察MCF-7細(xì)胞和表達(dá)熒光素酶的MCF-7-luc 細(xì)胞的生長情況。MCF-7-luc clone26、MCF-7-luc clone27和MCF-7有相似的生長趨勢(圖4?？梢?穩(wěn)定表達(dá)Luciferase 的細(xì)胞株在構(gòu)建過程沒有對MCF-7細(xì)胞的生長特性產(chǎn)生較大影響。圖4MCF-7-luc 和母細(xì)胞MCF-7的生長曲線的比較24裸鼠皮下移植瘤模型的建立MCF-7-l

20、uc clone26細(xì)胞對BLAB /c 裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種后第5d 通過活體成像系統(tǒng)能檢測到腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光信號,隨著時間的延長,熒光信號逐漸增強(qiáng)。在接種后第20d 熒光信號達(dá)到最強(qiáng)(光子數(shù)=64106(圖5,隨熒光信號逐漸減弱,此時裸鼠開始消瘦,膚色變暗,出現(xiàn)晚期癌癥患者的惡質(zhì)化現(xiàn)象。隨后處死裸鼠并解剖。綜上所述,MCF-7-luc 細(xì)胞能成功構(gòu)建裸鼠皮下成瘤移植瘤模型,該模型能更靈敏、更直觀地反映腫瘤在動物體內(nèi)的生長情況。圖5活體成像檢測皮下接種的MCF-7-luc 在裸鼠體內(nèi)的生長情況25移植瘤病理形態(tài)改變MCF-7-luc 細(xì)胞移植瘤鏡下癌細(xì)胞排列巢狀、團(tuán)索狀,癌細(xì)胞大小形

21、態(tài)各異,胞漿豐富,細(xì)胞核大深2013年第18卷第1期張繪宇等:利用熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞建立活體成像動物模型71染,核分裂象多見,腫瘤中央可見局灶壞死。與MCF-7細(xì)胞對照組沒有差別,都符合乳腺癌組織細(xì)胞特征(圖6。 圖6皮下接種MCF-7-luc 模型的乳腺癌組織學(xué)結(jié)構(gòu),示癌細(xì)胞形態(tài)(HE 4003討論活體動物成像技術(shù)是近期發(fā)展起來的一種新型影像檢測技術(shù),是檢測動物體內(nèi)分子及細(xì)胞事件的強(qiáng)有力手段。利用生物發(fā)光成像(BLI 可以對活體病灶的大小進(jìn)行無損傷直觀準(zhǔn)確檢測9,具有極高的檢測靈敏度及低廉的實驗費(fèi)用。來源于螢火蟲的熒光素酶基因被人工分離并克隆到載體上,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)的熒光素酶在ATP 、

22、氧及底物L(fēng)uciferin 存在時,熒光素酶催化Luciferin 的氧化反應(yīng)可以產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。生物發(fā)光優(yōu)點在于安全、實時、準(zhǔn)確,為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程和抗腫瘤藥效動物實驗提供了科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)10。因此被廣泛用于腫瘤轉(zhuǎn)移,基因治療,干細(xì)胞示蹤等相關(guān)研究11。熒光素酶基因作為體內(nèi)報告源的生物發(fā)光標(biāo)記,具有靈敏、高效、易于檢測等特性。研究中標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的體外生物發(fā)光結(jié)果顯示細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞的數(shù)目呈顯著線性關(guān)系,為判斷腫瘤的大小提供了直觀的量化數(shù)據(jù)。而要將這種標(biāo)記用于活體動物成像,首先要獲得在非選擇條件下長期、穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞系。本研究利用lipofectam ine2000,將攜帶熒

23、光素酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中,獲得了具有穩(wěn)定高表達(dá)lucifer-ase 的陽性克隆,并且證實了熒光素酶基因在MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。在體外實驗中,我們首先鑒定了MCF-7-luc 的細(xì)胞數(shù)量與發(fā)光強(qiáng)度具有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)R 2=0986,并且,其發(fā)光能力強(qiáng),最低可檢測到大約156個細(xì)胞。這種相關(guān)性的存在,為判斷腫瘤的大小提供了直觀的量化數(shù)據(jù),從而為直接利用生物發(fā)光強(qiáng)度判斷腫瘤的生長及藥物反應(yīng)等研究提供了前提12。用標(biāo)記熒光素酶基因的細(xì)胞株MCF-7-luc 建立裸鼠皮下移植瘤模型。因熒光素酶基因在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定,故可以間接反映腫瘤在體內(nèi)生長情況。在肉眼尚不

24、能發(fā)現(xiàn)腫瘤的時候即可使用該方法觀察、量化活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長,這就使得在還未觸及腫瘤的情況下即可開始對動物皮下移植瘤模型進(jìn)行藥物處理成為可能。利用活體動物成像技術(shù)可以連續(xù)示蹤腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長情況,可以對同一研究個體進(jìn)行長時間跟蹤成像,避免靠不同時間宰殺動物獲取實驗數(shù)據(jù),降低了實驗成本以及動物組間人為操作誤差。為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制和藥物治療的選擇提供了新的工具。本研究建立了穩(wěn)定整合luciferase 的人乳腺癌MCF-7-luc 細(xì)胞系,并建立了以該細(xì)胞系為基礎(chǔ)的乳腺癌裸鼠移植瘤模型,為利用活體成像技術(shù)探討乳腺癌的生長轉(zhuǎn)移機(jī)制及進(jìn)行抗癌藥物的研發(fā)提供了穩(wěn)定可靠、直觀、方便、靈敏的動

25、物模型。參考文獻(xiàn)(References 1Donato B M ,Burns L ,Willey V ,et alTreatment pat-terns in patients with advanced breast cancer who were exposed to an anthracycline ,a taxane ,and capecit-abine :a descriptive report J Clinical Therapeutics ,2010,32(3:5465542Brutkiewicz S ,Mendonca M ,Stantz K ,et alThe ex-pres

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