低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)帕金森病大鼠行為學(xué)的影響

1、    低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)帕金森病大鼠行為學(xué)的影響作者：孫秀巧 王彥永 王銘維 孫海民 郭記宏 時(shí)軍 王培芝    作者單位：050031 石家莊,河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科/河北省腦老化與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室【摘要】  目的 探討0.5 Hz重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(rTMS)對(duì)帕金森病大鼠行為學(xué)的影響。方法 取健康SD大鼠45只，用6OHDA毀損右側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)與中腦腹側(cè)背蓋(VTA)制備偏側(cè)帕金森病模型。用阿撲嗎啡(APO)腹腔注射篩選，將成功的20只帕金森病鼠隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組10只。治療組給

2、予rTMS治療，頻率為0.5 Hz，刺激強(qiáng)度為閾上30%，連續(xù)20個(gè)刺激，每天1次，連續(xù)刺激2周。對(duì)照組予以假刺激。在治療前、治療結(jié)束后第1天、14天、28天分別測定APO誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、啟動(dòng)潛伏期的變化。結(jié)果 (1)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(r/min)：治療組與對(duì)照組在治療結(jié)束后第14天為(9.7±3.0 vs 14.6±2.6)、28天為(9.2±2.7 vs 14.2± 2.6)，治療組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組在治療結(jié)束后第14天、28天與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較

3、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)啟動(dòng)潛伏期(s):治療組與對(duì)照組rTMS治療結(jié)束后第1天(25±9 vs 39±16)、第14天(18±7 vs 42±16)、第28天(17±7 vs 42±16)比較，治療組啟動(dòng)潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組各時(shí)間點(diǎn)與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 0.5 Hz、閾上30%刺激強(qiáng)度的rTMS可改善PD大鼠的行為學(xué)異常?！娟P(guān)鍵詞】  帕金森病 磁療法 行為學(xué) 大鼠磁刺激(m

4、agnetic stimulation，MS)是一種無痛、無創(chuàng)、快捷的神經(jīng)電生理技術(shù)，可以影響中樞及外周神經(jīng)的功能活動(dòng)，并且可以通過調(diào)節(jié)頻率、強(qiáng)度、刺激間歇及持續(xù)時(shí)間來影響神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，因而對(duì)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在治療作用。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)對(duì)帕金森病(Parkinsons disease,PD)的療效目前尚無一致結(jié)論。為此，本實(shí)驗(yàn)利用健康SD大鼠建立6羥基多巴胺(6OHDA)偏側(cè)PD模型。應(yīng)用rTMS技術(shù)對(duì)模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察rTMS對(duì)PD的治療作用。  

5、60; 1  材料與方法    1.1  材料    1.1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠45只，體質(zhì)量270300 g，鼠齡34個(gè)月。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。    1.1.2  主要試劑與儀器： SR6N腦立體定向儀(日本)、肌電/誘發(fā)電位儀、Magstim220型磁刺激儀和S90型圓形線圈(英國牛津公司)、5 l無存液微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)；6羥基多巴胺(6OHDA)、阿樸嗎啡(Sigma公司)。

6、0;   1.2  檢測方法    1.2.1  模型的制備及篩選: 將45只雄性SD大鼠按改良的Thomas1方法制作PD大鼠模型，10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉。參照文獻(xiàn)2確定右側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)、中腦腹側(cè)被蓋部(VTA)坐標(biāo)位置。用5 l微量注射器抽取4 g/l的6OHDA(溶于0.2%維生素C的生理鹽水中)，每個(gè)點(diǎn)注射2 l。于術(shù)后1周、2周進(jìn)行行為檢測，應(yīng)用阿樸嗎啡(apomorphine,APO)腹腔注射(0.5 mg/kg)，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為變化，觀測時(shí)間為1 h/次。規(guī)定大鼠恒定轉(zhuǎn)向左

7、側(cè),身體環(huán)曲，首尾相接，360度為一轉(zhuǎn)(r)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>210 r/30 min,為成功PD大鼠模型,否則予以淘汰。將造模成功的PD大鼠20只隨機(jī)分為對(duì)照組、治療組各10只。    1.2.2  干預(yù)方法： 治療組給予rTMS治療，對(duì)照組予以假刺激。首先檢測靜息皮質(zhì)閾值(relaxed threshold,RT)：用水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉深度掌握在輕刺激尾部鼠有輕微活動(dòng)。使用Magstim 220型磁刺激儀和S90型圓形線圈，最大輸出磁場強(qiáng)度2.0 Tesla。線圈放在大腦半球，用同心圓針電極在下肢腓腸肌肌腹記錄對(duì)

8、側(cè)頭部刺激的誘發(fā)電位，單極針電極置于鼠尾作為接地電極。首先給予閾上強(qiáng)度刺激,記錄到波形、潛伏期基本恒定的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)后逐漸降低刺激強(qiáng)度,連續(xù)5次刺激至少引出3個(gè)峰峰波幅0.2 mV的最小刺激強(qiáng)度定為安靜狀態(tài)時(shí)的后肢RT3。將清醒的PD大鼠置于一長圓形器具中,頭部暴露，刺激部位為引出RT的位置。將線圈緊貼大鼠的前腦部皮膚進(jìn)行閾上30%刺激(實(shí)際刺激強(qiáng)度為最大輸出強(qiáng)度的40%60%)，刺激頻率為0.5 Hz，連續(xù)20個(gè)刺激，每天治療1次，連續(xù)刺激2周。    1.3  效果評(píng)價(jià)  在治療前、治療結(jié)束后第1天、14天、28天分別測定APO誘

9、導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、啟動(dòng)潛伏期的變化。    1.3.1  旋轉(zhuǎn)圈數(shù)檢測： 應(yīng)用APO腹腔注射(0.5 mg/kg)，計(jì)數(shù)開始旋轉(zhuǎn)后0.5h內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以每分鐘的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。    1.3.2  啟動(dòng)潛伏期的檢測： 采用僵住實(shí)驗(yàn)，測試裝置為一垂直的柵欄，高44 cm，寬55 cm，每兩個(gè)水平橫桿間距為1 cm。測試時(shí)將大鼠放于柵欄之上，使其四爪均抓住橫桿，當(dāng)大鼠抓牢后開始計(jì)時(shí)，大鼠左前爪子開始移動(dòng)時(shí)停止計(jì)時(shí)，此時(shí)的時(shí)間稱為啟動(dòng)潛伏期，以秒(s)為計(jì)數(shù)單位，每只鼠均測試5次，每次間隔5 min，取平均值進(jìn)行統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)分析。    1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以±s表示，不同時(shí)間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)；啟動(dòng)潛伏期2組間同一時(shí)間點(diǎn)比較因不符合正態(tài)分布，經(jīng)均衡檢驗(yàn)后采用符號(hào)秩和檢驗(yàn)(wilcoxon配對(duì)法),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)  果    2.1  APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較  2組治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；治療組治療結(jié)束后第1天旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有

11、所下降，但與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療結(jié)束后第14天、28天旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，與治療前、對(duì)照組同一時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。表1  2組同一時(shí)間點(diǎn)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較 注：與治療前比較，P<0.05;與對(duì)照組比較，P<0.05    2.2  啟動(dòng)潛伏期  治療前2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療組rTMS治療結(jié)束后第1天、第14天、第28天啟動(dòng)潛伏期明顯縮短(P0.05)，與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較

12、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。表2  2組不同時(shí)間點(diǎn)啟動(dòng)潛伏期的比較注：與治療前比較，P<0.05;與對(duì)照組比較，P<0.05    3  討  論    與單次、成對(duì)磁刺激比較,rTMS可以對(duì)皮質(zhì)興奮性產(chǎn)生較為持久的影響,并隨頻率和強(qiáng)度的改變而起不同的作用。高頻率rTMS(>5 Hz,有文獻(xiàn)報(bào)道為>1 Hz)可以提高皮質(zhì)的興奮性,而低頻rTMS則抑制皮質(zhì)的興奮性。    經(jīng)顱

13、磁刺激技術(shù)盡管已應(yīng)用到PD患者的診斷和治療，但研究結(jié)果并不一致。多數(shù)研究認(rèn)為有不同程度的效果4，5，但Okabo等6用0.2 Hz,1.1皮質(zhì)活動(dòng)閾值，每次100個(gè)刺激，每周1次，共8周，與假刺激組相比，沒有發(fā)現(xiàn)rTMS的優(yōu)勢。這可能因?yàn)榕R床PD患者混雜因素多，且受藥物情緒的影響較大，故很難達(dá)到條件一致性。而本研究采用PD大鼠模型，通過運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(TMSMEP)檢測運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)靜息閾值，并給予rTMS治療，彌補(bǔ)了以上不足。6OHDA PD模型是國際公認(rèn)的PD動(dòng)物模型，其行為檢測明顯,神經(jīng)化學(xué)改變更接近人類PD。APO誘導(dǎo)的PD大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元受損的程度呈正相關(guān)，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)可以作為反

14、映PD大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元受損程度的指標(biāo)。運(yùn)動(dòng)遲緩、起步困難是PD的一個(gè)典型癥狀，僵住實(shí)驗(yàn)為一種可行的檢查手段。因此，我們利用這2個(gè)指標(biāo)來判斷rTMS對(duì)PD模型大鼠行為的影響。    多數(shù)研究認(rèn)為PD患者的皮質(zhì)閾值降低，興奮性較正常人高，而低頻rTMS可以抑制皮質(zhì)的興奮性。故本試驗(yàn)選用頻率0.5Hz、閾上30%強(qiáng)度，每天一個(gè)序列，連續(xù)刺激2周的方法。結(jié)果顯示APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)治療組隨時(shí)間延長逐漸下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大鼠患肢的啟動(dòng)潛伏期治療組較對(duì)照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明低頻rTMS可以改善PD

15、的行為學(xué)，并延緩病情進(jìn)展。Mally等7也有同樣的報(bào)道，他比較了單純藥物組與藥物加磁刺激治療組在藥量、癥狀的惡化等方面的差異。接受磁刺激(頻率1 Hz)治療者每年至少2次，每次7 d，連續(xù)3年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁刺激治療組盡管治療之初病情重、左旋多巴用量大，但3年之后無病情惡化，且未發(fā)現(xiàn)不良作用；而單純藥物組不但左旋多巴的用量明顯增加，且病情明顯惡化。    rTMS作用機(jī)制：(1)可能通過調(diào)節(jié)兒茶酚胺的代謝而發(fā)揮作用。Ohnishi等8研究發(fā)現(xiàn)rTMS可影響腦內(nèi)兒茶酚胺的代謝，促進(jìn)同側(cè)內(nèi)源性多巴胺釋放，使同側(cè)尾狀核周圍多巴胺增多，并可以抑制大腦內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺的分解，進(jìn)

16、而調(diào)節(jié)患側(cè)紋狀體蒼白球直接環(huán)路和間接環(huán)路的興奮性，改善運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀。(2)可能與神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌有關(guān)。經(jīng)過長時(shí)間rTMS刺激后，腦源性生長因子mRNA的表達(dá)在海馬、頂葉和梨狀區(qū)皮質(zhì)明顯增高。在低頻rTMS刺激后，在海馬可以見到苔狀纖維芽生9。林宏等10等觀察到rTMS 14 d后SD大鼠蒼白球外側(cè)部和腹側(cè)蒼白球HMW MAP2染色明顯增強(qiáng)，纖維明顯增粗，推測rTMS可能通過樹突重塑導(dǎo)致突觸傳遞的變化而發(fā)揮其臨床作用。(3)可能與調(diào)節(jié)皮質(zhì)的興奮性有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Thomas J,Wang J,Takuba H,et al.A 6OHDA induced selective Park

17、insonian rat model:further biochemical and behavioural characterizationJ.Exp Neurol,1994,126(2):159161.2 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜M.北京：人民衛(wèi)生出版社,1991:4854.3 嚴(yán)莉,豐宏林,崔麗英.經(jīng)顱重頻磁刺激對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)興奮性和神經(jīng)功能的影響J.中國臨床康復(fù),2006,10(18):7981.4 Siebner HR,Rossmeier C,Mentschel C,et al.Shortterm motor improvement after subth

18、reshold 5Hz repetitive transcranial magnetic stimulation of the primary motor hand area in Parkinson's diseaseJ.J Neurol Sci,2000,178(2):9194.5 Fregni F,Sontos CM,Myczkowski ML,et al.Repititive transcranial magnetic stimulation in Parkinson's diseaseJ.Neurol Neurosueg Psychiatry,2004,75(8):1

19、 1711 174.6 Okabo S,Ugawa Y,Kanazawa I.0.2Hz repetitive transcranial magnetic stimulation has no addon effects as compared to a realistic sham stimulation in Parkinson's diseaseJ.Mov Disord,2003,18(4):382388.7 Mally J,Farkas R,Tothfalusi L,et al.Longterm followup study with repetitive transcranial