傳染性軟化病病毒（桐鄉(xiāng)株）的nested RT-PCR檢測(cè)及

1、傳染性軟化病病毒（桐鄉(xiāng)株）的nested RT-PCR檢測(cè)及其RNA聚合酶的克隆和表達(dá)    英文題名 Detection of Infetious Flacherie Virus(Chinese Isolate) by Nested RT-PCR and Expression of the Viral RNA Polymerase  中文摘要 病毒性軟化病是一種嚴(yán)重影響蠶業(yè)生產(chǎn)的流行病,其病原為傳染性軟化病病毒(infectious flacherie virus, IFV)。雖然類似軟化病的情況在許多國(guó)家都有發(fā)生,但確切分離到IFV毒株的只

2、有日本。作為世界上最大養(yǎng)蠶國(guó)的中國(guó),在分離鑒定IFV上存在著很長(zhǎng)一段時(shí)間的空白。 本實(shí)驗(yàn)室2002年在桐鄉(xiāng)蠶區(qū)分離到一株RNA病毒,在形態(tài)學(xué)觀察等基礎(chǔ)上,本研究用兩對(duì)嵌套引物對(duì)該病毒進(jìn)行分子鑒定。Nested RT-PCR結(jié)果證明該病毒在兩輪反應(yīng)中均能特異性擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的片段?；厥漳康臈l帶進(jìn)行測(cè)序后得到一段217bp的序列,通過(guò)BLAST搜索,發(fā)現(xiàn)該片段與IFV日本株相應(yīng)區(qū)域匹配,核苷酸序列相似性達(dá)99.5%,氨基酸完全同義。由此可確定該病毒為IFV,這是我國(guó)首次分離到該病毒,暫命名為IFV Zhejiang01/2002/CHN。 以IFV Zhejiang01/2002/CHN基因

3、組RNA為模板,用RT-PCR擴(kuò)增了其RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)編碼區(qū)全長(zhǎng)序列。將片段連入pMD18-T載體進(jìn)行克隆。測(cè)序顯示編碼RdR. 英文摘要 Flacherie disease of silkworm, Bombyx mori is a viral disease causing serious loss of sericulture. The causative agent of this disease  摘要 8-9 ABSTRACT 9-10 第1章 文獻(xiàn)綜述 11-39   &

4、#160; 1.1 小RNA病毒概況 11-21         1.1.1 小RNA病毒的分類學(xué)地位 11         1.1.2 小RNA病毒的結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)組成 11-13         1.1.3 小RNA病毒的復(fù)制 13-16         1.1.4 小RNA病毒的翻譯 16-18  &#

5、160;      1.1.5 小RNA病毒的蛋白質(zhì)加工 18-20         1.1.6 昆蟲小RNA樣病毒 20-21     1.2 傳染性軟化病病毒(IFV)研究進(jìn)展 21-30         1.2.1 軟化病及其病原的研究歷史 21-22         1.2.2 IFV粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和

6、理化特性 22-23         1.2.3 IFV的基因組 23-24         1.2.4 IFV的蛋白組 24-27         1.2.5 IFV的病理學(xué) 27-28         1.2.6 IFV的分類學(xué)地位 28-29       

7、;  1.2.7 IFV的檢測(cè)手段 29-30     1.3 RNA依賴性RNA聚合酶研究進(jìn)展 30-39         1.3.1 RdRp的分類和功能 30-31         1.3.2 RdRp的整體結(jié)構(gòu) 31-32         1.3.3 RdRp的結(jié)構(gòu)域 32-34      

8、   1.3.4 RdRp的保守基序 34-35         1.3.5 RdRp的催化機(jī)制 35-37         1.3.6 RdRp在抗病毒治療中的應(yīng)用 37-39 第2章 IFV(桐鄉(xiāng)株)的nested RT-PCR檢測(cè) 39-47     2.1 材料 40         2.1.1 生物材料 40  

9、60;      2.1.2 酶和試劑 40         2.1.3 引物 40         2.1.4 溶液 40     2.2 方法 40-44         2.2.1 病毒的增殖 40-41         2.2.2

10、病毒的純化 41-42         2.2.3 RNA模板的制備 42-43         2.2.4 RT-PCR 43-44         2.2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序及BLAST搜索 44     2.3 結(jié)果 44-45         2.3.1 Nested RT-PCR

11、結(jié)果 44-45         2.3.2 BLAST搜索和序列分析 45     2.4 討論 45-47 第3章 IFV(桐鄉(xiāng)株)RNA聚合酶的克隆及序列分析 47-60     3.1 材料 48-49         3.1.1 病毒 48         3.1.2 載體和菌株 48   

12、0;     3.1.3 引物 48         3.1.4 酶和其他試劑 48-49         3.1.5 溶液和培養(yǎng)基 49     3.2 方法 49-54         3.2.1 病毒RNA的抽提 49         3.2.

13、2 反轉(zhuǎn)錄 49         3.2.3 PCR擴(kuò)增RdRp 49-50         3.2.4 擴(kuò)增片段的回收 50         3.2.5 連接 50-51         3.2.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備 51-52         3

14、.2.7 轉(zhuǎn)化 52         3.2.8 抽提質(zhì)粒DNA 52-53         3.2.9 重組質(zhì)粒的鑒定 53         3.2.10 質(zhì)粒的序列測(cè)定 53         3.2.11 序列分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建 53-54     3.3 結(jié)果 54-58  

15、;       3.3.1 RdRp的RT-PCR擴(kuò)增 54-55         3.3.2 重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定 55         3.3.3 RdRp序列的測(cè)定和分析 55-56         3.3.4 RdRp多重序列對(duì)比 56-57       

16、  3.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 57-58     3.4 討論 58-60 第4章 IFV RdRp在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá) 60-72     4.1 材料 61-62         4.1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞 61         4.1.2 引物 61         4.1.3 酶和其他試劑 61-6

17、2         4.1.4 溶液和培養(yǎng)基 62     4.2 方法 62-68         4.2.1 RdRp片段的擴(kuò)增和回收 62         4.2.2 供體質(zhì)粒的構(gòu)建 62-64         4.2.3 重組供體質(zhì)粒的鑒定和測(cè)序 64   &#

18、160;     4.2.4 轉(zhuǎn)座 64-65         4.2.5 重組Bacmid的分離 65-66         4.2.6 重組Bacmid的鑒定 66         4.2.7 重組Bacmid轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞 66         4.2.8 重組桿狀病毒的收

19、集和增殖 66-67         4.2.9 蛋白表達(dá)和蛋白樣品的制備 67         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結(jié)果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴(kuò)增 68         4.3.2 重組供體質(zhì)粒的鑒定 6

20、8         4.3.3 重組質(zhì)粒部分序列的測(cè)定 68-69         4.3.4 重組Bacmid的鑒定 69-70         4.3.5 蛋白樣品的SDS-PAGE 70     4.4 討論 70-72 結(jié)論和展望 72-73 參考文獻(xiàn) 73-84 附錄A 常用緩沖液和培養(yǎng)基 84-90 附錄B 縮略詞 90-91 附錄C Bac-t

21、o-Bac系統(tǒng)工作原理 91-92 Writings&Sequences 92-93         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結(jié)果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴(kuò)增 68         4.3.2 重組供體質(zhì)粒的鑒定 68     

22、60;   4.3.3 重組質(zhì)粒部分序列的測(cè)定 68-69         4.3.4 重組Bacmid的鑒定 69-70         4.3.5 蛋白樣品的SDS-PAGE 70     4.4 討論 70-72 結(jié)論和展望 72-73 參考文獻(xiàn) 73-84 附錄A 常用緩沖液和培養(yǎng)基 84-90 附錄B 縮略詞 90-91 附錄C Bac-to-Bac系統(tǒng)工作原理 91-92 Writings&am

23、p;Sequences 92-93         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結(jié)果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴(kuò)增 68         4.3.2 重組供體質(zhì)粒的鑒定 68         4.3.3 重組質(zhì)粒部分序

24、列的測(cè)定 68-69         4.3.4 重組Bacmid的鑒定 69-70         4.3.5 蛋白樣品的SDS-PAGE 70     4.4 討論 70-72 結(jié)論和展望 72-73 參考文獻(xiàn) 73-84 附錄A 常用緩沖液和培養(yǎng)基 84-90 附錄B 縮略詞 90-91 附錄C Bac-to-Bac系統(tǒng)工作原理 91-92 Writings&Sequences 92-93         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結(jié)果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴(kuò)增 68         4.3.2 重組供體質(zhì)粒的鑒定 68         4.3.3 重組質(zhì)粒部分序列的測(cè)定 68-69