TA克隆-T載體

1、TA 克隆概述 TA 克隆載體即 T 載體，是目前克隆 PCR 產(chǎn)物最簡(jiǎn)便、快捷的方法。隨著基因組計(jì)劃的進(jìn)行，以及分子生物學(xué)技術(shù)、基因芯片技術(shù)在生命科學(xué)研究、生物工程和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì) TA 載體的需求量會(huì)逐步擴(kuò)大TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能，在每條 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的 3 端自動(dòng)添加一個(gè) 3-A 突出端。利用 TaKaRa 的 T 載體，直接高效地連接 PCR 產(chǎn)物。 所以 TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，不需把 PCR 產(chǎn)物做平端處理，不需在 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物上加

2、接頭，即可直接進(jìn)行克隆。原理如下： TA克隆的策略摘要： 對(duì)于亞克隆來說，酶切-連接可謂是最經(jīng)典的方式。雖說效果不錯(cuò)，可著實(shí)有些麻煩。載體和片段分別酶切、跑膠、回收，再加上連接和轉(zhuǎn)化，一星期轉(zhuǎn)眼就過去了。新的克隆方法也在不斷涌現(xiàn)。速度更快，片段更長(zhǎng)。生物通近期就將盤點(diǎn)一下市場(chǎng)上一些非一般的克隆。從TA克隆開始，我們著重于一些容易忽視的問題。TA 克隆的 idea 最初來自 1994 年。幾位學(xué)者發(fā)現(xiàn)Taq DNA 聚合酶會(huì)在PCR 產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)脫氧腺苷（A），而且這種特性與模板無關(guān)。之后，Invitrogen 公司發(fā)明了 TA 克隆技術(shù)，并擁有全球 TA cloning 商標(biāo)的專利權(quán)，

3、直至 2013 年。（這個(gè)就夠他們賺得盆滿缽滿了。）線性化的 T 載體在 3末端擁有一個(gè)脫氧胸苷（T），與 PCR 產(chǎn)物的 A 尾巴互補(bǔ)。原理就是這么簡(jiǎn)單。不過由于價(jià)格的原因，Invitrogen 的 T 載體在國(guó)內(nèi)卻不是銷量最好的。Promega 的 pGEM-T（easy）和 Takara的 pMD18-T 因性價(jià)比高，更加深入人心。 TA 克隆的步驟無需贅述，相信大家都很清楚。無非就是 PCR、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定這幾個(gè)步驟，不過還有一些不得不說的問題，值得大家注意。用什么樣的聚合酶？ 不是所有的聚合酶都會(huì)在PCR 產(chǎn)物末端加A。具有 3到 5外切酶活性的高保真酶就不會(huì)產(chǎn)生 A尾巴。如果你下

4、一步想要做基因表達(dá)，一定要用高保真酶，那也沒問題。只要用 Taq 酶在產(chǎn)物末端加個(gè) A 就 OK。步驟也很簡(jiǎn)單，根本無需買個(gè)什么加A 試劑盒，幾步就搞定了。 1. 用高保真酶擴(kuò)增完之后，在反應(yīng)管中加入0.7-1 unit 的 Taq 聚合酶。無需更換 buffer，其中的 dATP 已經(jīng)夠用。 2. 在 72孵育 8-10 分鐘。3. 立即進(jìn)行純化，沉淀、跑膠、或用純化試劑盒。這一點(diǎn)相當(dāng)重要，否則高保真聚合酶會(huì)將 A尾巴或 T 載體上的 T 尾巴切掉。 有些高效率的聚合酶其實(shí)是 Taq 酶和高保真酶的混合物，大約有一半的產(chǎn)物加了 A 尾巴。所以你在克隆之前最好搞清楚你用的酶到底是否加A，否則克

5、隆出來白斑太少，又要討論好久。 PCR 產(chǎn)物的純度 如果你的 PCR 產(chǎn)物只有唯一條帶，恭喜你。不過為保險(xiǎn)起見，最好還是用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒來純化一次。否則白色菌落中的插入片段可能是引物二聚體哦。如果你發(fā)現(xiàn)有非特異條帶，那最好優(yōu)化一下 PCR 反應(yīng)，讓非特異條帶消失。跑膠純化是下策，因?yàn)槟z純化可能會(huì)帶走 3的 A 尾巴。而且注意不要在紫外燈下暴露太久。只需 5 秒，紫外對(duì) DNA 的傷害就足以檢測(cè)；而長(zhǎng)達(dá) 60 秒的照射會(huì)讓某段序列在測(cè)序時(shí)無法讀取。問題遠(yuǎn)比你想象中嚴(yán)重。 生物通提示：PCR 產(chǎn)物其實(shí)也有保質(zhì)期。為了保證連接效率，PCR產(chǎn)物最好不要超過一天。因?yàn)樯厦娴?A 尾巴會(huì)隨著時(shí)間

6、逐漸降解，導(dǎo)致連接效率下降。千萬不要為了省事，就整個(gè)一大管PCR 產(chǎn)物，每次用一點(diǎn)。最終反而更浪費(fèi)時(shí)間。載體和片段的比例 往往是影響克隆效果的最大因素。通常來說，載體與片段的起始摩爾比為 1：1。計(jì)算方法如下： X ng PCR 產(chǎn)物 = （ng 載體 × kb 片段大小）/ kb 載體大小 如果這樣的比例不能令你滿意，你可以在 3：1 到 1：3 的范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳的比例。PCR 產(chǎn)物的濃度可以通過與 Marker 比對(duì)估算出來。還有一種更準(zhǔn)確的方法，用 GE 的 NanoVue超微量分光光度計(jì)。只需要 0.5 ul，就能測(cè)量出樣品濃度，你再也不用舍不得珍貴的樣品了。0.5

7、 ul而已，小意思。對(duì)照 托爾斯泰曾說過：“幸福的家庭總是相似的，不幸的家庭各有各的不幸。”實(shí)驗(yàn)也是如此。失敗的實(shí)驗(yàn)總有各種各樣的緣由。對(duì)照在實(shí)驗(yàn)失敗時(shí)就凸顯其重要性了。 陽性對(duì)照 一般在購買 TA 克隆的 kit 時(shí)，都會(huì)附帶陽性對(duì)照。你應(yīng)該在第一次實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，就按照說明書上對(duì)照反應(yīng)的步驟，同時(shí)進(jìn)行陽性對(duì)照，以檢驗(yàn)PCR 和連接反應(yīng)是否有問題。而不是在失敗了七八次之后，才想起陽性對(duì)照。浪費(fèi)了時(shí)間不說，如果你的樣品很珍貴，那誰也無力回天。一般說來，起碼有 60%以上的菌落應(yīng)該是白色的。 自連對(duì)照 這個(gè)對(duì)照是檢驗(yàn) T 載體的 T 尾巴是否還在。如果轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)大量菌落，這個(gè) T 載體一定有問題。 轉(zhuǎn)化對(duì)照 每一次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)都應(yīng)該設(shè)立對(duì)照。自家制備感受態(tài)細(xì)胞是這樣，購買現(xiàn)成的感受態(tài)更是這樣。因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)胞非常敏感，絕對(duì)不能凍融。從外地長(zhǎng)途運(yùn)輸過來，誰知道中途發(fā)生過什么事。為保險(xiǎn)起見，一定要轉(zhuǎn)化一個(gè)環(huán)狀的質(zhì)粒（非 T 載體，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)線性化了）作為