甲基硝基亞硝基胍誘發(fā)的遺傳不穩(wěn)定細(xì)胞DNA聚合酶βmRNA表

1、甲基硝基亞硝基胍誘發(fā)的遺傳不穩(wěn)定細(xì)胞DNA聚合酶mRNA表達(dá)水平研究*摘要目的和方法：本實驗室曾報道，低濃度0.2 mol/L烷化劑甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)可以誘導(dǎo)哺乳類細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定狀態(tài)。為明確其發(fā)生機(jī)制，本文利用定量RT-PCR方法，研究了該低濃度MNNG對人HeLa及猴腎vero細(xì)胞DNA聚合酶(pol ) mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果：經(jīng)0.2 mol/L MNNG 2.5 h處理后，HeLa細(xì)胞pol mRNA水平在624 h內(nèi)升高約1倍；而vero細(xì)胞pol mRNA水平在1230 h內(nèi)亦升高1倍左右。結(jié)

2、論：提示pol mRNA水平改變可能參與MNNG誘發(fā)細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定的發(fā)生。主題詞誘變；DNA聚合酶類；基因表達(dá)；聚合酶鏈反應(yīng) mRNA expression of DNA polymerase in MNNG induced genetically unstable cellsFENG Zhao-Hui, YU Ying-Nian, CHEN Xing-RuoDepartment of Pathophysiology and Laboratory of Molecular Biology, Zhejiang Medical University, Hangzhou (310031)Abstra

3、ct AIM and METHODS: It was reported from our laboratory that low concentration N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) could induce genetic instability in mammalian cells. To elucidate its mechanism, quantitative RT-PCR was used to study mRNA expression of DNA polymerase in MNNG induced genetical

4、ly unstable cells. RESULTS：It was demonstrated that mRNA level of polymerase increased by nearly one-fold in HeLa cells from the 6th to 24th hour after being treated with 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h;and the same was demonstrated in vero cells from 12 th to 30 th hour after 0.2 mol/L MNNG treatment. CON

5、CLUSION：The alteration of polymerase expression might be involved in the genesis of MNNG induced genetic instability in mammalian cells.MeSHMutagenesis; DNA polymerase; Gene expression; polymerase chain reaction化學(xué)物質(zhì)或離子輻射可以誘發(fā)哺乳類細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定狀態(tài)(genetic instability)，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確1。本室證實低濃度0.2 mol/L烷化劑甲基硝基亞硝基胍(N-

6、methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)處理細(xì)胞2.5 h，可誘發(fā)細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定狀態(tài)產(chǎn)生2；同時有DNA復(fù)制保真度明顯下降3，及許多基因表達(dá)水平的改變4；轉(zhuǎn)錄抑制劑可阻斷該狀態(tài)產(chǎn)生5。提示其產(chǎn)生與有關(guān)基因表達(dá)水平改變有關(guān)。許多研究提示DNA聚合酶(pol )可能與MNNG誘發(fā)細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定有關(guān)。pol 具有較低的DNA復(fù)制保真度，及較強(qiáng)的跨損傷誤性DNA修復(fù)等特性。MMS、 AAF、 H2O2、 TPA及大劑量MNNG(20 mol/L)可誘導(dǎo)細(xì)胞pol mRNA水平的改變；甲基亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)誘導(dǎo)的小鼠

7、胸腺淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有DNA復(fù)制保真度下降及pol mRNA水平升高8；對烷化劑耐受的腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)pol 表達(dá)水平改變9。為明確MNNG誘發(fā)的遺傳不穩(wěn)定細(xì)胞中是否有pol 表達(dá)水平的改變，我們對0.2 mol/L MNNG處理后的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，及猴腎vero細(xì)胞中pol mRNA水平進(jìn)行了研究。材料與方法一、細(xì)胞培養(yǎng)及處理：單層生長的HeLa,vero細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中。用0.2 mol/L MNNG(Sigma, 0.1% 二甲基亞砜DMSO作溶劑)處理細(xì)胞2.5 h后，經(jīng)徹底漂洗，加入新鮮培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)一定時間，對照組細(xì)胞用0.1% D

8、MSO處理2.5 h。二、PCR引物合成：根據(jù)Genbank公布的人類基因序列，合成人pol 及2-微球蛋白基因(2m) 等二對PCR引物(上海細(xì)胞所)。其中pol 引物分別為：5-CTT TGA GAA GAA CGT GAG CC-3(正義)，5-CTC GTA TCA TCC TGC CGA AT-3(反義)，PCR產(chǎn)物長210 bp; 2m引物分別為：5-C ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3(正義)，5-C ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3(反義)，PCR產(chǎn)物長120 bp。三、定量RT-PCR分析基因mRNA表達(dá)水平：用TRIZol試劑

9、(Gibco)按廠家說明書上方法提取HeLa細(xì)胞總RNA。取2 g細(xì)胞總RNA， 0.5 g d(N)6隨機(jī)引物，200 mol/L-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)，25 L總體積，37反應(yīng)1.5 h逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈。取對照組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 L， 20 pmol pol 及內(nèi)參照 2m基因PCR引物，總體積50 L，對兩基因同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 1 min, 57 35 s, 72 1 min。從20個循環(huán)數(shù)起，每增加3個循環(huán)數(shù)進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，直至40個循環(huán)數(shù)為止。產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙錠染色，紫外燈下拍照，對產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行光密度掃描，計算po

10、l 和2m條帶光密度比值(OD pol/OD 2m)，以確定PCR定量擴(kuò)增靶基因的合適循環(huán)數(shù)。分別取各處理組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 L，嚴(yán)格按上述條件和選定的合適PCR循環(huán)數(shù)，對pol 和2m基因同時進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物按上述方法進(jìn)行定量分析，pol 基因表達(dá)水平以pol 和2m PCR產(chǎn)物電泳條帶光密度比值(OD pol /OD 2m)來表示。各樣本至少重復(fù)3次RT-PCR過程。按上述方法，利用人2m， pol基因PCR引物對MNNG處理后的vero細(xì)胞中pol基因mRNA水平進(jìn)行定量分析。結(jié)果以 2m基因為內(nèi)參照，擴(kuò)增對照組HeLa細(xì)胞中pol基因。對經(jīng)溴乙錠染色的產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行光密度掃描

11、，發(fā)現(xiàn)從23至32個循環(huán)間，pol和2m基因PCR產(chǎn)物條帶光密度比值(OD pol/OD2m)恒定。表明在此循環(huán)數(shù)范圍內(nèi)，pol和2m基因均呈指數(shù)擴(kuò)增，適合作定量分析。故此選定27個循環(huán)數(shù)作為定量RT-PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(1)。Fig 1 RT-PCR products of DNA polymerase and 2-microglobin in HeLa cells after amplification with different PCR cycle numbers. Lane 1: pGEM-7zf(+)Hae marker. OD pol/OD 2m: Lane 2:0.584; L

12、ane 3:0.713; Lane 4:0.552; Lane 5:0.654; Lane 6:1.116;1經(jīng)不同PCR循環(huán)數(shù)擴(kuò)增后的HeLa細(xì)胞中DNA聚合酶和2-微球蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物HeLa細(xì)胞經(jīng)0.2 mol/L MNNG處理2.5 h后，分別于0， 6， 12， 24， 36 h，提取總RNA， 以2m基因為內(nèi)參照，對pol 進(jìn)行定量RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件同前，循環(huán)數(shù)為27個。產(chǎn)物電泳條帶經(jīng)光密度掃描，分別計算OD pol/OD 2m比值，每樣本至少經(jīng)3次定量RT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pol在MNNG處理細(xì)胞后624 h間升高約1倍左右(2，表1)。Fig 2 RT-P

13、CR products of DNA polymerase gene in HeLa cells treated with 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h. Lane 1: pGEM-7zf(+) Hae marker. Lane 2: control; Lane 37:0.2 mol/L MNNG2經(jīng)0.2 mol/L MNNG 2.5 h處理后，HeLa細(xì)胞中DNA聚合酶基因RT-PCR產(chǎn)物表1經(jīng)0.2 mol/L MNNG 2.5 h處理后的HeLa, vero細(xì)胞中DNA聚合酶基因mRNA表達(dá)水平Tab 1 mRNA expression of DNA polymer

14、ase in HeLa, vero cells after treatment of 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h (s, n=3)OD pol/OD 2mControlTime after MNNG treatment(h)03612243036HeLa0.6280.1240.5970.136+1.1520.165*1.2130.173*1.0840.126*0.5870.078Vero0.4850.0860.4630.0620.3120.0740.4760.1050.9750.092*1.0130.081*0.9640.116*0.5100.075Quantitativ

15、e RT-PCR was used to amplify pol and 2m gene in cells. PCR products were electrophoresed and the bands were measured with optical density scanning. The expression levels of pol were expressed as the ratio of the bands of pol to that of 2m (OD pol /OD2m)*P0.05, vs control group利用人2m, pol基因PCR引物，對vero

16、細(xì)胞中相應(yīng)基因進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其RT-PCR產(chǎn)物大小與 HeLa細(xì)胞中的大小完全一致。由于上述兩基因所選定的PCR引物及擴(kuò)增區(qū)域cDNA序列非常保守，在果蠅、小鼠、人不同真核生物中均有很高的同源性，故此認(rèn)為所得產(chǎn)物即為2m,pol基因。發(fā)現(xiàn)從23至32個循環(huán)間，兩基因均呈指數(shù)擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物帶光密度比值恒定。在此基礎(chǔ)上，同樣用27個循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對MNNG誘發(fā)的遺傳不穩(wěn)定vero細(xì)胞pol mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)在0.2 mol/L MNNG處理后1230 h內(nèi)pol mRNA水平升高約1倍(3，表1)。Fig 3 RT-PCR products of DNA polymer

17、ase gene in vero cells treated with 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h. Lane 17: 0.2 mol/L MNNG; Lane 8: control; Lane 9: pGEM-7zf(+) Hae marker3經(jīng)0.2 mol/L MNNG 2.5 h處理后，vero細(xì)胞中DNA聚合酶和RT-PCR產(chǎn)物討論目前為止，在哺乳類細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有五類核DNA聚合酶(pol ,，)，分別參與DNA復(fù)制、修復(fù)以及DNA損傷后誘發(fā)突變形成等過程，與DNA復(fù)制保真度直接相關(guān)。其表達(dá)水平可以被某些烷化劑、射線所誘導(dǎo)，在某些腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有所改變6，7

18、。我們曾通過定量RT-PCR方法對0.2 mol/L MNNG處理后的HeLa細(xì)胞中DNA pol ，及 mRNA水平進(jìn)行了動態(tài)觀察，均未見明顯改變。目前對pol研究尚未透徹，由于缺少35核酸外切酶校讀活性，pol在體外DNA聚合反應(yīng)中有很高的單堿基錯誤摻入率(1/1000-1/6600)，為復(fù)制保真度最低的DNA聚合酶。它可以通過堿基切除修復(fù)途徑參與烷化劑、射線造成的DNA損傷修復(fù)。同時，pol 具有很強(qiáng)的跨損傷易誤性DNA修復(fù)功能，在體外能夠跨過AP位點或d(GpG)-順鉑加合物等DNA損傷，造成堿基缺失或替換突變6，7。最近發(fā)現(xiàn)，pol能跨06-mG損傷(MNNG造成的主要DNA損傷類型

19、)，在新鏈相應(yīng)位置上插入一d(A)，認(rèn)為是烷化劑損傷后造成細(xì)胞GA突變的重要原因10?？紤]到pol的特性，尤其是復(fù)制的低保真度，本實驗中MNNG處理后細(xì)胞中pol表達(dá)水平的上升，是否與MNNG誘發(fā)細(xì)胞DNA復(fù)制保真度下降及遺傳不穩(wěn)定發(fā)生有關(guān)，我們擬通過反義RNA技術(shù)阻斷細(xì)胞中pol基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞非定標(biāo)性突變率是否有明顯改變，進(jìn)一步研究在進(jìn)行之中。* 國家自然科學(xué)基金(No.39870684)、浙江省自然科學(xué)基金(No.397454)資助作者單位：浙江醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室及分子生物學(xué)實驗室(杭州310031)參考文獻(xiàn)1Murnane JP. Role of induced genetic

20、 instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation. Mutat Res, 1996, 367:11.2Zhang X, Yu Y, Chen X. Evidece for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence spectificity using a shuttle-vector plasmid. Mutat Res, 1994, 323:105.3馮朝暉，余應(yīng)年，張小山，等.MNNG誘發(fā)的遺傳不穩(wěn)定vero細(xì)胞中DNA體外復(fù)制保真度的研究.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1998，12(2)：144.4胡文蔚，余應(yīng)年，張小山，等.N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍引起Vero細(xì)胞基因表達(dá)改變及有關(guān)cDNA片段的初步鑒定.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1998，12：62.5孫雪敏，余應(yīng)年，張小山，等.轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制對哺乳類細(xì)胞非定標(biāo)性突變形成的影響.癌變.畸變.突變，1996，8：286.6Budd ME, Campbell JL. The roles of the eukaryotic DNA p